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.2015年7月15日；21(14):3263-73.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1200。 Epub 2015年3月26日。

氨氧乙酸靶向乳腺癌谷氨酰胺代谢

普雷西·科兰加特 1, 魏文涛 1, 海伦·萨迪克 1, 韩良凤 1, 森喜朗 2, 夏洛特·梅·胡伊茨（Charlotte M Huijts） 1, 弗洛恩·威尔德斯 2, 桑托什·巴蒂 2, Zhe Zhang（张哲） 1, 塞萨尔·圣玛丽亚 1, 蔡华玲 1, 池V当 三, Vered Stearns公司 1, Zaver M Bhujwalla先生 2, 萨拉斯瓦提·苏库马尔 4
附属公司

氨氧乙酸靶向乳腺癌谷氨酰胺代谢

普雷西·科兰加特等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：转氨酶抑制剂氨基氧乙酸（AOA）可靶向c-MYC过度表达乳腺癌中的谷氨酰胺成瘾。然而，随后的细胞死亡机制仍未解决。

实验设计：研究了乳腺癌细胞系中谷氨酰胺依赖性生长与c-MYC表达之间的相关性。研究了AOA的细胞毒性作用，它与c-MYC高表达的相关性，以及对谷氨酸分解途径中酶的影响。通过磁共振波谱（MRS）测量代谢产物水平的变化，通过细胞周期和溴脱氧尿苷（BrdUrd）摄取分析测量氨基酸耗竭对核苷酸合成的影响，以及内质网（ER）应激介导的途径的激活，来评估AOA诱导的细胞死亡。在免疫缺陷小鼠乳腺癌异种移植瘤和转基因MMTV-rTtA-TetO-myc小鼠乳腺肿瘤模型中，测定AOA加或不加常规化疗的抗肿瘤作用。

结果：我们在大多数乳腺癌细胞中建立了c-MYC过度表达、谷氨酰胺分解抑制和AOA敏感性之间的直接关系。MRS、细胞周期分析和BrdUrd摄取测量表明，天冬氨酸和丙氨酸的消耗导致AOA将细胞周期阻滞在S期。通过GRP78启动的内质网应激介导途径的成分激活导致凋亡细胞死亡。AOA抑制SUM159、SUM149和MCF-7异种移植物的生长以及c-myc过度表达转基因小鼠乳腺肿瘤。在MDA-MB-231中，AOA仅在联合化疗时有效。

结论：AOA主要通过应激反应途径调节其细胞毒性作用。AOA有效性的临床前数据为进一步临床开发提供了强有力的依据，尤其是对于c-MYC过度表达的乳腺癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露

V.Stearns报告称，其获得了Abbvie、Abraxis、Medimmune、Merck、Novartis和辉瑞公司的商业研究拨款。其他作者没有透露任何潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
乳腺癌细胞系的谷氨酰胺依赖性。A、 乳腺细胞系在含有完整或还原谷氨酰胺（Gln和Gln-R）的培养基中生长。显示了指定日期每孔（3孔/时间点；两次重复）的平均活细胞数。B、 转氨酶和其他与谷氨酰胺分解有关的基因的示意图。C、 mRNA差异表达GOT1、GOT2、GLS2、和GPT2项目在乳腺癌细胞系中与正常乳腺类器官和HMEC进行比较（每个试验重复；三次重复）。曼惠特尼测试，*,P（P）< 0.05. D、 在含有完整（Gln）的培养基中生长后谷氨酸分解途径中基因的RT-qPCR+)或还原谷氨酰胺（Gln−)24小时（每次试验重复；三次重复）；Mann-Whitney检验；*,P（P）< 0.05.
图2
图2
乳腺癌细胞对AOA的敏感性及其在GOT1/2和GPT2缺失的细胞中的逆转。A、 用2mmol/L AOA处理48小时后，对乳腺癌细胞株和正常HMEC进行MTT分析。B、 逆转AOA对GOT1、GOT2和GPT2缺失的SUM149细胞的细胞毒作用。C、 RT-qPCRGOT1、GOT2、和GPT2项目SUM149细胞中的mRNA缺失所示基因。D、 AOA处理（2 mmol/L）后GOT1和GOT2的酶活性在暴露6小时后显示出显著抑制。每个实验重复三次。学生的所有统计分析t吨测试；双尾；*,P（P）< 0.05.
图3
图3
AOA敏感性依赖于c-MYC。A、 乳腺癌细胞c-MYC蛋白的Western blot分析；用负载控制β-actin标准化密度测定评价；以及c-MYC蛋白水平和AOA敏感性之间的相关性。用2mmol/L AOA处理48小时后存活的细胞百分比（来自图2A）相对于同一细胞系中c-MYC蛋白的量绘制。斯皮尔曼相关第页= 0.664;*,P（P）< 0.05. B、 siRNA介导的SUM149和SUM159细胞c-MYC耗竭。AOA处理48小时的细胞的MTT分析。稳定表达c-MYC shRNA的SUM159细胞与Scr shRNA表达细胞（左）对AOA的敏感性比较；集落形成分析显示，MYC缺失的SUM159细胞不依赖谷氨酰胺生长（右）。C、 MTT法检测AOA对过度表达外源性C-MYC的HCC1954乳腺癌细胞的影响。D、 MTT法检测AOA在两种小鼠乳腺肿瘤细胞系中的作用。Western blot分析显示，与未诱导FVB/N小鼠乳腺MG1和MG2相比，c-myc在两种肿瘤细胞系MTC1和MTC2中过度表达。数值表示为三个独立实验的平均值±SD，针对B到D的每个条件测试了4个孔。所有数据都由学生分析t吨测试，双尾；*,P（P）< 0.05.
图4
图4
A、 经AOA处理的SUM159细胞的MRS分析显示丙氨酸和天冬氨酸显著减少，但谷氨酸没有减少(*,P（P）< 0.05). B、 MTT分析显示在含有不同量AOA的10 mmol/L天冬氨酸存在下培养48小时的活细胞百分比(*,P（P）< 0.01). C、 AOA诱导S期阻滞，通过添加天冬氨酸逆转。使用PI对暴露于载体、AOA、天冬氨酸或AOA+天冬氨酸酯72小时的SUM159细胞的细胞周期进行流式细胞术分析，显示亚G增加1AOA处理细胞的含量和S期阻滞；用天冬氨酸进行共处理可以逆转这种效应。D、 BrdUrd掺入和保留对S期阻滞的稳定性。对细胞进行BrdUrd和PI染色，流式细胞仪分析显示，AOA（2mmol/L）处理48和72小时后，BrdUrd阳性细胞显著增加。数值表示为A到D的三个独立实验的平均值±SD。所有数据均由学生分析t吨测试，双尾。
图5
图5
AOA诱导生长抑制和死亡的分子机制。A、 SUM159和SUM149细胞的RT-qPCR分析显示，暴露于2 mmol/L AOA 24小时后，内质网应激标记物被诱导（每次检测重复；三次重复检测）。学生t吨测试，双尾*,P（P）≤ 0.05. B、 在暴露于2 mmol/L AOA 72小时后，对AOA敏感的SUM159和AOA不敏感的BT474和HCC202细胞株进行应激标记物和凋亡标记caspase-3的Western blot分析。C、 AOA处理48或72小时后，通过向SUM159和SUM149细胞添加天冬氨酸来逆转ER应激标记物和caspase-3的诱导；条形图，定量。D、 AOA在乳腺癌细胞中的作用机制示意图。
图6
图6
体内AOA的生长抑制作用。A、 将SUM149、SUM159或HCC1954细胞皮下注射到无胸腺Balb/c小鼠中。当肿瘤达到100毫米时三，小鼠被随机分为对照组（PBS）或AOA（5 mg/kg i.p.，每日）治疗组(n个=6-8只小鼠/组）。B、 SUM159、SUM149和HCC1954异种移植物应激途径标记物的Western blot分析。实验结束时收集肿瘤。C、 在MDA-MB-231异种移植物中，AOA与阿霉素、卡铂或紫杉醇的组合显示出生长抑制作用。数据绘制为平均值±SEM，并通过混合效应模型与Tukey程序进行比较，以进行多次测试修正。D、 左侧，用PBS治疗荷瘤MMTV-rTtA-TetO-myc小鼠(n个=10）或AOA 0.5 mg/kg（静脉注射3天/周；n个= 5). 当肿瘤达到150至200毫米时开始治疗三并持续4周。没错，接受AOA治疗的动物的体重与车辆治疗的动物相比没有显著下降。方差分析；*,P（P）= <0.0001.
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