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.2015年4月；125(4):1591-602.
doi:10.1172/JCI78239。 Epub 2015年3月23日。

补偿性谷氨酰胺代谢促进胶质母细胞瘤对mTOR抑制剂治疗的耐药性

田中和弘, 佐山隆志, 伊里野康宏, 高田久美, Hiroaki Nagashima公司, 佐藤直子, Katsusuke Kyotani公司, 三佐木隆志, 泰奇罗·伊马霍里, 雅索·埃希玛, 肯塔·马苏, 比阿特丽斯·基尼, 杨慧君, 细田康一, 佐佐木良惠, 保罗·S·米切尔, Eiji Kohmura公司

补偿性谷氨酰胺代谢促进胶质母细胞瘤对mTOR抑制剂治疗的耐药性

田中和弘等。 临床研究杂志. 2015年4月.

摘要

雷帕霉素（mTOR）的机制靶点在多种癌症中过度激活，使其成为引人注目的药物靶点；然而，mTOR抑制对癌症代谢重编程的影响尚不完全清楚。在这里，通过整合多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系、临床前模型和临床样本的代谢和功能研究，我们证明谷氨酰胺代谢的代偿性上调促进了对mTOR激酶抑制剂的耐药性。GBM细胞的代谢组学研究表明，mTOR激酶抑制剂治疗后谷氨酰胺酶（GLS）和谷氨酸水平升高。此外，在GBM异种移植模型中证实了这些mTOR抑制剂依赖的代谢改变。mTOR抑制剂治疗后GLS的表达以α-酮戊二酸依赖（α-KG依赖）的方式促进GBM存活。mTOR激酶和GLS的基因和/或药理学联合抑制在荷瘤小鼠中导致大规模协同肿瘤细胞死亡和生长抑制。这些结果强调了谷氨酰胺代偿代谢在促进mTOR抑制剂耐药性中的关键作用，并表明合理的联合治疗有可能抑制耐药性。

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数字

图7
图7。mTOR和GLS抑制都会减弱TCA循环的能量生成，导致GBM中的细胞死亡。
mTOR激酶抑制剂治疗GBM细胞后，GLS和谷氨酸水平升高。结合mTOR激酶抑制剂和GLS抑制剂为GBM患者提供了合理的治疗策略。
图6
图6。在体内，mTOR和GLS抑制均显示协同抑制肿瘤生长。
(A类)每只小鼠皮下注射1×106U87（左侧）和U87/EGFRvIII（右侧）单元。通过腹腔注射PP242（5 mg/kg）和/或化合物968（5 mg/kg.）治疗荷瘤小鼠。对照组接受等量的二甲基亚砜。植入15天后开始治疗。在指定的时间点测量5只小鼠每个异种移植的肿瘤体积（折叠变化）。数据表示3个独立实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. (B类)U87/EGFRvIII异种移植物样本的代表性图像，采用TUNEL染色（棕色细胞）评估凋亡细胞。用ImageJ软件对TUNEL染色进行定量。数据表示每组3个独立图像的平均值±SEM***P（P）< 0.001. 比例尺：50μm。(C类)针对U87/EGFRvIII异种移植物样品中TCA循环相关代谢物、丙酮酸和草酰乙酸、柠檬酸和异柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸的GC/MS分析。数据表示每组3个独立异种移植物的平均±SEM*P（P）< 0.05. (D类)每天腹腔注射PP242和/或化合物968对各组小鼠体重变化的影响。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验。另请参见补充图10-13。
图5
图5。作为对mTOR抑制的反应，GLS以αKG依赖的方式促进GBM细胞的存活。
(A类)代谢物dm-αKG（10 mM）经1μM PP242和1μM化合物968处理3天后，对U87/EGFRvIII细胞的存活能力进行了测试。通过台盼蓝排除法计算细胞死亡。数据表示3个独立实验的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. (B类)GC/MS分析针对用1μM PP242和/或1μM化合物968与正常DMEM或DMEM与dm-αKG（10 mM）处理24小时的U87/EGFRvIII细胞中TCA循环相关代谢物、丙酮酸和草酰乙酸、柠檬酸和异柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸。数据表示3个独立实验的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图4
图4。GLS抑制使GBM细胞对mTOR靶向治疗敏感。
(A类)用2种GLS siRNA和干扰对照siRNA构建物转染U87和U87/EGFRvIII细胞24小时，并换成10%FBS培养基2天。细胞数表示3个独立实验的平均值±SEM。(B类)谷氨酰胺相对摄取量和NH4+对照GLS敲除U87和U87/EGFRvIII细胞的产量。数据表示3个独立实验的平均值±SEM*P（P）<0.05，根据双尾学生t吨测试。(C类)使用U87/EGFRvIII细胞的指示抗体进行免疫印迹分析，该抗体带有针对GLS的siRNA结构，或使用PP242或对照DMSO处理2天的对照LacZ。GLS、p-AKT（Ser473）和AKT的图像是使用相同的细胞裂解液从另一个凝胶中获得的。(D类)TUNEL染色的U87/EGFRvIII GBM细胞的代表性图像。用抗GLS的siRNA转染细胞，并用1μM PP242或DMSO处理对照LacZ 2天。用ImageJ软件对TUNEL阳性细胞进行定量。数据表示每组3个独立图像的平均值±SEM**P（P）<0.01，根据双尾学生的t吨测试。比例尺：100μm。(E类)用1μM PP242和/或1μM化合物968处理2天的U87/EGFRvIII和SVGP12细胞的TUNEL染色。用ImageJ软件对TUNEL阳性细胞进行定量。数据代表每组3张独立图像的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验***P（P）< 0.001. 另请参见补充图6–9。
图3
图3。GLS蛋白和谷氨酸水平的代偿性升高使GBM细胞能够存活于mTOR抑制剂治疗。
(A类和B类)细胞内水平我-谷氨酸盐(A类)和αKG(B类)用1 nM雷帕霉素、1μM PP242或对照DMSO处理U87/EGFRvIII GBM细胞48小时。数据代表3个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001，根据双尾学生t吨测试。(C类)示意图显示了本研究中针对的谷氨酰胺分解酶。二磷酸腺苷；Pi，磷酸盐。(D类)信使核糖核酸水平GS公司,GLS公司，溶质结合载体家族A1(SLC1A5型)、和GDH公司在U87和87/EGFRvIII细胞中。用1 nM雷帕霉素、1μM PP242或对照DMSO处理细胞48小时。数据表示3个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，根据双尾学生t吨测试。(E类)用PP242治疗的EGFRvIII表达U87的异种移植物获得的GLS免疫组织化学图像(n个=2）或控制DMSO(n个=2），持续5天。组织用苏木精复染。比例尺：50μm。从每组的6个独立图像中测量相对染色强度**P（P）<0.01，根据双尾学生t吨测试。另请参见补充图2-5和补充表1。
图2
图2。比较代谢组学确定谷氨酸是一种潜在的代谢物，可促进对mTOR抑制剂治疗的耐药性。
经1 nM雷帕霉素、1μM PP242和对照二甲基亚砜处理48小时的U87/EGFRvIII GBM细胞中差异表达的代谢物2D层次聚类的热图表示。每列代表一个治疗组，每行代表一种代谢物。
图1
图1。GBM患者肿瘤中谷氨酰胺和谷氨酸水平及GLS表达升高。
(A类)针对68岁GBM患者肿瘤（红色）和对侧正常脑（蓝色）区域的谷氨酰胺和谷氨酸的MRS研究。胆碱、谷氨酰胺和麸胺酸复合物以及NAA的峰值分别约为3.22、2.4和2.0 ppm的化学位移。Cho，胆碱；Cr，肌酸；谷氨酰胺；谷氨酸、谷氨酸。(B类)12例GBM患者肿瘤和对侧正常脑区MRS研究中的谷氨酰胺和谷氨酸水平。根据肿瘤和对侧正常脑VOI的肌酸和磷酸肌酸计算谷氨酰胺和谷氨酸的相对水平*P（P）< 0.05; ***P（P）<0.001，根据双尾学生t吨测试。(C类)关键酶的mRNA水平包括GLS公司和GS公司在12名GBM患者中，谷氨酰胺和谷氨酸之间存在差异。相对水平GLS公司GS表示为肿瘤/正常脑（T/N）的表达比率。(D类)6例GBM患者肿瘤切除后获得的肿瘤和正常脑组织中GLS染色的免疫印迹分析。另请参见补充图1。
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