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.2015年4月；17(4):458-69.
doi:10.1038/ncb3132。 Epub 2015年3月16日。

端粒束调节减数分裂着丝粒组装

迈克尔·克劳茨坦 1, 亚历克斯·芬内尔 1, 阿方索·费尔南德斯-阿尔瓦雷斯 1, 朱莉娅·普罗米尔·库珀 1
附属公司

端粒束调节减数分裂着丝粒组装

迈克尔·克劳茨坦等。 Nat细胞生物学. 2015年4月.

摘要

一个多世纪以来，保守的减数分裂端粒花束的作用一直是个谜。我们之前已经证明，分裂酵母花束的破坏会损害大约一半减数分裂细胞中纺锤的形成。令人惊讶的是，具有功能纺锤体的花束不足的减数分裂细胞含有无法实现纺锤体附着的染色体。动粒蛋白和着丝粒组蛋白H3变异体Cnp1未能定位于那些在花束缺失时表现出纺锤状附着缺陷的着丝粒。HP1同源基因Swi6也不能结合这些着丝粒，表明着丝粒周围异染色质受损是动粒缺陷的基础。我们发现，着丝粒在减数分裂期间容易解体，但这一点被着丝粒定位于端粒近端微环境所逆转，这有利于异染色质的形成和着丝粒的重组。因此，人工将着丝粒系在端粒上可以拯救被系的着丝粒，但不能拯救其他着丝粒。这些结果揭示了端粒对着丝粒的控制程度出乎意料。

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数字

图1
图1
花束不足的减数分裂细胞显示染色体无法附着到正确形成的纺锤体上。(a–c)减数分裂细胞膜上的一系列框架。分别通过编码Hht1（红色）的两个等位基因之一的外源性表达GFP–Atb2（绿色）和内源性mRFP标记观察到管蛋白和组蛋白H3。帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。(一)wt减数分裂。在MI和MII，所有染色体都能正确地附着在双极纺锤体上。另请参阅补充视频1。(b条)bqt1Δ减数分裂。纺锤体形成正确，但一些染色体（箭头）未能附着在纺锤体上并保持不分离。另请参阅补充视频2。(c（c）)rap1Δ减数分裂。一些染色体（箭头）的纺锤体附着失败，如bqt1Δ减数分裂。(d日)通过标记组蛋白H3观察到的非附着事件频率的量化（表示为中期后染色体保持在中间的细胞百分比）。拍摄的细胞数量显示在每条车道的上方。星号表示与使用Fisher精确检验计算的wt存在显著差异（wt–bqt1ΔP=0.007，重量–区域1 P=0.02，详见方法）。(e（电子）)单个染色体的非附着事件的频率表示为具有着丝粒或端粒亚区的细胞在后期后保持不分离的百分比。Chr I非附件通过cenI–TetO/R系统（见正文）。Chr II非附件通过cenII–TetO/R系统（见正文）。变更。通过Reb1–GFP对III非依恋进行评分（见正文）。每个染色体的百分比总和与中显示的总比率相匹配d日表明整个染色体（而不是片段）无法分离。拍摄的细胞数量显示在每个条形图上方。
图2
图2
花束不足的减数分裂细胞不能正确组装动粒。(a、 b)减数分裂细胞膜上的一系列框架。Cnp1和染色质分别通过体外表达的Cnp1–GFP（见正文）和Hht1–mRFP（如图1所示）观察到。标签如图1所示。(一)wt减数分裂。Cnp1–GFP出现在MI和MII的所有染色质肿块中。(b条)bqt1Δ减数分裂。一些染色体（箭头）无法招募Cnp1并保持未分组状态。(c、 d日)减数分裂细胞膜上的一系列框架。观察到内源性标记的功能性Swi6–GFP以及cenI–TetO/R. (c（c）)wt减数分裂。Swi6–GFP被正确地募集到着丝粒I(d日)bqt1Δ减数分裂。在某些情况下，着丝粒I无法招募Swi6，并且仍然没有被隔离（箭头所示）。比例尺英寸a–d代表5μm。(e（电子）)未分离染色体Cnp1定位的量化。叠加的色码指定了每个遗传背景中Cnp1–GFP信号的模式。有关稳定和不稳定的定义，请参见方法。拍摄的细胞数量显示在每条车道的上方。星号表示与使用Fisher精确检验计算的wt存在显著差异（wt–bqt1ΔP=0.0003). (（f）)着丝粒I上Swi6定位的量化。e（wt–bqt1ΔP=0.02）。(克)着丝粒II上Swi6定位的量化（通过可视化cenII–TetO/R). e中的标签（wt–bqt1ΔP=0.002，详见方法）。
图3
图3
着丝粒周围异染色质形成缺陷的减数分裂细胞显示着丝粒组装缺陷。(一)有丝分裂与减数分裂中着丝粒功能对异染色质组装因子需求的比较。通过GFP–Atb2 Hht1–mRFP（如图1所示）观察到的非连接事件的频率如下所示(clr4Δ有丝分裂-clr4Δ减数分裂的P（P）=3×10−7;dcr1Δ有丝分裂-dcr1Δ减数分裂的P（P）=0.0003). 拍摄的细胞数量显示在每个条形图上方。(b条)有丝分裂与减数分裂中异染色质组装因子对Cnp1负载的需求比较。叠加的色码规定了这些着丝粒（有丝分裂-减数分裂）上Cnp1–GFP信号的模式P（P）=0.00005). 拍摄的细胞数量显示在每个条形图上方。参见稳定和不稳定信号的指定方法。(c（c）)着丝粒上Cnp1定位的遗传上位性分析。叠加的颜色代码指定Cnp1–GFP信号的模式，如b条。拍摄的细胞数量显示在每个条的上方。星号表明所有突变背景与wt显著不同；不同突变基因型（wt–bqt1ΔP= 10−5，重量–clr4ΔP= 10−4，重量–clr4Δbqt1ΔP=0.0002). (d日)所示背景中MI（蓝色）与MII（红色）中偏析缺陷的比较。通过GFP–Atb2 Hht1–mRFP观察到的非附着事件的频率（如图1所示）如图1所示。拍摄的细胞数量显示在每个条形图上方。bqt1Δ和bqt1Δclr4Δ与之相比，MI中的减数分裂细胞表现出更多的缺陷clr4Δ减数分裂细胞在MII中表现出更多的缺陷（见正文解释）。(e（电子）)减数分裂细胞膜上的一系列框架。Cnp1、微管蛋白和染色质分别通过体外表达的Cnp1–GFP、Atb2–mCherry和Hht1–CFP观察到。标签如图1所示。染色体（箭头）无法招募Cnp1并保持未分组状态。(（f）)减数分裂细胞膜上的一系列框架。如图1所示，观察到管蛋白和组蛋白H3。比例尺英寸e、 （f）代表5μm。箭头表示在MI和MII处未能分离的染色体。
图4
图4
动粒组装受损不是马尾运动或减数分裂重组减少的结果。如图2所示，在缺乏Dhc1的细胞中评估了Cnp1–染色质关联，这是强有力的减数分裂前期核（“马尾”）运动所必需的。在dhc1Δ减数分裂细胞，花束形成，但减数分裂重组水平降低。(a、 b)减数分裂细胞膜上的一系列框架。Cnp1和染色质的评估如图2所示。这些示例显示dhc1Δbqt1Δ染色质团块细胞未能附着在纺锤体上，缺乏稳定的Cnp1–GFP信号（箭头所示）。帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。(c（c）)量化Cnp1定位。对于每个遗传背景，绘制了含有未分离染色体的细胞的百分比；叠加色码指定这些细胞中Cnp1–GFP信号的模式。有关稳定和不稳定的定义，请参见方法。拍摄的细胞数量显示在每个条形图上方。（重量–bqt1Δdhc1 P= 0.0001,bqt1Δdhc1Δ-dhc1ΔP=0.04，详见方法）。在dhc1Δ所有未分离的染色体均显示稳定的Cnp1–GFP焦点。在dhc1Δbqt1Δ减数分裂细胞是着丝粒的一个亚群，在减数分裂前期始终与SPB相关。然而，缺乏Cnp1–GFP的未分离染色质团的发生并没有受到抑制。
图5
图5
靠近端粒促进减数分裂着丝粒组装。(一)端粒和着丝粒在减数分裂前期开始时共存。每18秒拍摄一次共有减数分裂细胞（用于增加减数分裂培养的同步性）。分别通过内源性标记和功能性Mis6–GFP和Taz1–mCherry观察着丝粒和端粒。黄色箭头表示端粒-着丝粒共同定位，白色箭头表示从SPB释放着丝粒子集。(b条)与花束相关的染色体受到保护，免受着丝粒组装缺陷的影响。左图：染色体纺锤体附着失败评估的基因组图。三条染色体中的每一条都已循环。Chr III上的粉红色椭圆代表通过结合Taz1–YFP可见的内部端粒重复束。右图：独立染色体的量化。在15%的细胞中观察到未分离的染色体（Chr I和Chr II），但含有内部端粒（Chr III）的染色体从未分离。(c（c）)与端粒花束无关的染色体存在着丝粒缺陷。左：显示Chr I的着丝粒通过cenI–lacO/I公司（绿色椭圆）和Chr III包含内部端粒拉伸。Chr III上的内部端粒拉伸不能保护Chr I或Chr II上的着丝粒。右图：独立染色体的量化。Chr III和Chr I的分离率（比较b条和c（c）)差异显著(P（P）=0.006，见方法）。(d日)在b条细胞含有Taz1和Sid4（SPB蛋白）的内源性标记和功能等位基因，以及标记的微管蛋白和组蛋白H3，如图1所示。帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。未分离的染色体（白色箭头）不显示Taz1信号。(e（电子）)从经历减数分裂的圆形+内部telo细胞的代表性薄膜中获得的一系列帧，如c（c）.通过以下方式观察Chr IcenI–lacO/I; 微管蛋白(第2天)组蛋白H3如图1所示。帧下的数字表示MI之前或之后的分钟数。比例尺表示5μm。两个Chr I同源物（白色箭头）未能连接到纺锤。
图6
图6
进入花束微环境的着丝粒受到保护，不会出现装配缺陷。(一)（i）-（iii）分离缺陷评估的基因组图。（i） Chr i的着丝粒通过cenI–lacO/I（绿色椭圆，如图5c所示）和Chr III包含在前期定位于SPB的内部端粒拉伸。（ii）通过LacI–GFP与Bqt1–GBP结合，Chr I的着丝粒被招募到SPB（见正文）。此外，Chr III包含内部端粒拉伸，因此定位于SPB。（iii）Chr I通过与Bqt1–GBP融合蛋白结合而被招募到SPB（见正文）。Chr III缺乏端粒重复序列，因此远离SPB。该图显示了图表中每个场景的Chr I分离缺陷的量化。招聘中央情报局如果SPB中也存在内部端粒，则前期对SPB具有保护作用，防止纺锤体附着失败；如果内部端粒缺失，尽管Chr I与SPB相连，但保护作用仍会失效。拍摄的细胞数量显示在每条车道的上方。(b条)圆形+内部telo减数分裂细胞代表性膜的一系列框架（在（ii）中评分）。通过以下方式观察Chr IcenI–lacO/I（如图5所示），组蛋白H3如图1所示。注意ChrI（绿点）向SPB（染色质条纹的末端）的补充，以及随后染色体与纺锤体的连接。帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。“圆形”菌株的MII很难清晰显示，因为缠结的染色质团在纺锤体溶解时迅速相互折叠。(c（c）)在（iii）进行减数分裂的“圆形”细胞的代表性胶片上拍摄的一系列画面。通过以下方式观察Chr IcenI–lacO/I（如图5所示），组蛋白H3如图1所示。帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。注意Chr I（绿点）向SPB的补充（染色质条纹结束）；然而，由于没有端粒拉伸共同定位于SPB，着丝粒I不能附着在纺锤体上。
图7
图7
参与花束的端粒数量与着丝粒附着能力之间的线性相关性。(一)携带圆形染色体的菌株与wt菌株交配产生一个减数分裂细胞，其中三条（线性）染色体与花束相关，三条（圆形）染色体不相关。这个减数分裂细胞对应于b条. (b条)给定细胞中没有端粒附着在SPB上的染色体数量与具有无功能着丝粒的细胞百分比之间的正线性相关。对五个菌株进行了评分：（I）来自交配wt菌株的减数细胞（所有染色体都参与束；因此，没有染色体从SPB分离，n个=87); （二） a中的减数分裂细胞含有三条线性（含端粒）和三条圆形（无端粒）染色体(n个= 82); （III） 来自交配的两个圆形+内部telo菌株（见正文）的减数细胞，交配类型相反（只有两条染色体参与束；因此，四条染色体从SPB分离n个= 94); （四） 如第三节所述，但删除了b季度1+，消除了内部端粒与SPB的结合（没有端粒参与花束；因此，六条染色体从SPB分离，n个= 55); （五） 来自两个完全缺乏端粒序列的环状染色体菌株交配的细胞（没有端粒参与花束，因此从SPB分离出6条染色体，n个=25). 虚线是线性拟合，R（右）2=0.87.
图8
图8
位于前期SPB而不存在端粒的着丝粒动粒功能受损。减数分裂细胞膜上的一系列框架。观察到内源性标记的Sad1–CFP（定位于SPB，蓝色）以及着丝粒II（红色，通过cenII–tetO/R)或着丝粒I（绿色，通过可视化中央情报局-lacO/I公司). 帧下的数字表示MI前后的分钟数。比例尺表示5μm。注意整个前期着丝粒和SPB的共同定位，以及随后的非附着表型中央二区或中央情报局（箭头）。
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参考文献

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