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.2015年2月16日；208(4):415-28.
doi:10.1083/jcb.201409058。

端粒和着丝粒在促进减数分裂纺锤体形成中具有互换作用

亚历克斯·芬内尔 1, 阿方索·费尔南德斯-阿尔瓦雷斯 1, Kazunori Tomita公司 2, 朱莉娅·普罗米尔·库珀 三
附属公司

端粒和着丝粒在促进减数分裂纺锤体形成中具有互换作用

亚历克斯·芬内尔等。 J细胞生物学. .

摘要

端粒和着丝粒传统上被认为发挥着不同的作用。在减数分裂前期，在称为花束的保守染色体结构中，端粒聚集在核膜（NM）上，通常靠近中心体。我们之前发现，在分裂酵母花束破裂后，中心体未能在减数分裂I和双极纺锤形核时插入NM。因此，端粒与中心体在前期的反-NM结合对纺锤体的有效形成至关重要。尽管如此，在大约一半花束不足的减数分裂细胞中，纺锤体形成正常。在这里，我们发现花束不足的细胞可以通过中心体接触而不是端粒-中心体的接触来成功进行减数分裂，从而形成纺锤体。因此，着丝粒和中心体之间的强制结合完全挽救了由束断裂引起的纺锤体缺陷。端粒和着丝粒都会刺激中心体下方SUN域蛋白Sad1的局部聚集，这表明它们具有共同的纺锤体生成能力的分子基础。我们的观察结果表明，这两个最显著的染色体标记之间存在意料之外的互换性。

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数字

图1。
图1。
救援bqt1Δ前期染色质–SPB接触导致纺锤缺陷。（A–C）来自携带Hht1-mRFP（组蛋白H3标记在两种内源性1型遗传性出血性毛细血管扩张症+位点；染色质）、Sid4-GFP（内源性标记；SPB）和外源性表达的GFP-Atb2(nmt1（纳米1）启动子调控；管蛋白）。编号表示减数分裂在分钟内进行；吨=0正好在主轴形成之前。棒材，5µm。（A） A类bqt1Δ接触时间<10分钟的减数分裂细胞显示单极性心肌梗死纺锤体和不稳定心肌梗死纺锤体。（B和C）bqt1Δ染色质与SPB接触10–19分钟和>30分钟的细胞（黄色箭头）在MI和MII处显示适当的纺锤体。（D） 染色质–SPB接触时间对双极心肌梗死纺锤体形成影响的定量研究。n个是八个独立实验中得分的细胞总数；数据经过Fisher精确检验：***，0.0001<P<0.001；**，0.001<P<0.01；*，0.01<P<0.05。对该图中A-D评分的所有细胞进行更广泛的分析图S1（C和D）。（E） 双极纺锤体的形成在异基因患者中比合子患者更常见bqt1Δ减数分裂。n个是从至少两个单元格中得分的单元格总数(重量)和超过八个(bqt1Δ)一系列应变背景下的独立实验；***，P<0.0001。（F） 合子和异子减数分裂中染色质–SPB接触频率的比较。n个是从>3开始评分的细胞总数(重量)且>10(bqt1Δ)独立实验（针对染色质–SPB接触数据）且≥5(重量和bqt1Δ)独立实验（针对着丝粒–SPB接触数据）。
图2。
图2。
着丝粒介导染色质-SPB接触，拯救bqt1Δ主轴缺陷。（A–C和H）来自携带Hht1-CFP（在图1中的单个内源性位点；染色质）、Sid4-mCherry（SPB）、外源性表达的mCherry-Atb2（Tubulin）和内源性标记的Mis6-GFP（A–G）或Cnp1-GFP（在内源性启动子控制下外源性表达；H）的减数分裂细胞膜的框架。棒材，5µm。（A） 在重量细胞，着丝粒在减数分裂前期不定位于SPB。（B）bqt1Δ细胞在前期出现<10分钟的着丝粒-SPB接触，随后纺锤体形成失败。（C和H）着丝粒-SPB接触持续>30分钟（用黄色箭头表示），随后形成双极纺锤体。（D） 在接触SPB期间着丝粒与非着丝粒染色质的水平bqt1Δ减数分裂前期。（E） 着丝粒与非着丝粒接触的寿命。（F） 的级别bqt1Δ双极性心肌梗死纺锤体形成见于具有特定类型染色质-SPB接触的细胞。由于Mis6-GFP信号的微弱性，在非中心>10-min接触（非中心>10min）中观察到的双极纺锤形成百分比可能被高估了。（G） 适当的纺锤体形成被量化为着丝粒-SPB接触持续时间的函数。n个是14个独立实验中得分的细胞数。对该图的所有单元格进行更广泛的分析图S1（E和F）.*，0.01＜P＜0.05。
图3。
图3。
在整个前期阶段将着丝粒保持在SPB，确保在没有花束的情况下形成纺锤。（A） 用于强制着丝粒–SPB相互作用的GBP-GFP系统示意图。（B–E）携带特定标签的减数细胞膜的框架：SPB、Mis6、染色质和微管蛋白标记，如图2所示；Bqt1在其C末端与GBP内源性融合。每个序列右侧的示意图显示了预期的前期表型（用蓝色虚线勾勒出核膜）。（B） 在rap1Δ缺乏着丝粒-SPB接触的细胞，Bqt1定位于非染色质相关的SPB，纺锤体形成缺陷。（C） A类rap1Δ着丝粒–SPB接触时间>30分钟的减数分裂细胞形成适当的双极纺锤体。（D） 年引入Bqt1英镑rap1ΔMis6上缺少GFP标记的细胞无法挽救异常纺锤体形成。（E） 在Bqt1-GBP设置中引入Mis6-GFP使SPB与着丝粒相关联，从而产生适当的双极纺锤体。棒材，5µm。（F） 双极心肌梗死心轴形成水平rap1Δbqt1-GBP有无Mis6-GFP的背景。n个是两个以上独立实验的细胞总数。***，P<0.0001。
图4。
图4。
Dhc1或Hrs1的缺失使着丝粒–SPB长期接触bqt1Δ合子。（A–F）所有标签如图2所示，Mis6-GFP标记着丝粒。棒材：（黑色）5µm；（灰色）1µm。（A） 年马尾运动期间SPB中没有着丝粒重量减数分裂前期。（B） 染色质偶尔在细胞分裂前期跟随SPBbqt1Δ细胞；零星着丝粒–SPB接触（插入并放大为黄色）导致双极纺锤体形成。（C和D）输入dhc1Δbqt1+和hrs1Δbqt1+合子，强烈的SPB运动被消除，但着丝粒从SPB释放。（E和F）相反，dhc1型Δbqt1Δ和hrs1Δbqt1Δ合子在整个发育前期至少在SPB上保持一个着丝粒，确保纺锤体的正常形成。（G） 虽然只有60%左右bqt1Δ细胞显示着丝粒–SPB接触，所有dhc1型Δbqt1Δ和大多数hrs1Δbqt1Δ细胞表现出这种相互作用。未观察到此类接触重量,dhc1Δ，或hrs1Δ细胞。分析使用Mis6-GFP作为着丝粒标记；这种标记物的模糊性解释了细胞的外观，在这种细胞中，在hrs1Δbqt1Δ设置。使用较亮的Swi6-GFP作为着丝粒的标记，我们观察到所有细胞都有接触（未描述）。（H） 定量显示完全恢复bqt1Δ主轴形成方式hr小时1+或dhc1型+删除。n个是六个以上独立实验的细胞总数。***，P<0.0001。（一） 根据着丝粒-SPB接触的寿命对合子进行分类。大多数dhc1Δbqt1Δ细胞显示“贯穿”（整个马尾期长度）前期着丝粒-SPB接触。对该图的所有单元格进行更广泛的分析图S1 G。所示数据来自三个独立的实验，每个实验分析50个以上的细胞。*，0.01<P<0.05。
图5。
图5。
无论花束状态如何，SPB都会发生沉淀。（A和B）带有内源性GFP标记的Hrs1和nmt1（纳米1）-控制Ish1-GFP（以可视化NM）以及指示标记（如图2所示）。棒材：（黑色）5µm；（灰色）1µm。（A） 在重量在减数分裂过程中，SPB与NM共定位。（B） 在bqt1Δ减数分裂细胞，只有在SPB运动停止后，即Hrs1-GFP消失后，SPB才会从NM上分离(吨= 0′). （C） A和B中所示表型的定量和计时来自三个独立实验，分析每个菌株的30个细胞。注意，在重量减数分裂细胞。的SPBbqt1Δ只有在Hrs1信号消失后，细胞才会从NM分离。前期、MI和MII期间Hht1-CFP（染色质）和Sid4-mCherry（SPB）的（D和E）钾谱图。SPB沉降阶段（黄色）放大显示。所示数据来自10次以上重复中的一次代表性实验。（F） 前期后SPB（通过Hrs1-GFP显示）沉降的时间（分钟）。n个是六个以上独立实验的细胞总数。误差条显示平均SD。
图6。
图6。
前期着丝粒–bqt1Δ设置显示的首选项cenIII级.（A） 在与着丝粒–SPB接触的细胞中，在远离SPB的地方观察到了额外的着丝粒病灶。箭头标记Mis6-GFP点，在期间远离SPBdhc1Δbqt1Δ前期。定量显示在右侧。在五个独立实验中，对100多个细胞进行了评分。（B–D）系列胶片框架hrs1Δbqt1Δ减数分裂。编号如图1所示；SPB通过内源性标记的Sad1-CFP查看。棒材：（黑色）5µm；（灰色）1µm。（B） 通过LacI-GFP结合物显示染色体I的着丝粒溶血素1+-拉科数组。（C） 染色体II的着丝粒通过TetR-bound可视化碳纳米管2-四氧化二铁数组。（D） 染色体III的着丝粒通过LacI结合ade6-lacO公司数组。在这些细胞中，Sad1内源性标记有mRFP。（E） 整理着丝粒–SPB相互作用。SPB与cenIII级比那些中央情报局或中央二区; 此外，中央二区–SPB互动比中央情报局–SPB交互。进行了五个以上的独立实验。对该图的所有单元格进行更广泛的分析图S1（H–J）。****，P＜0.0001。
图7。
图7。
与ARM-最大区域相比，CEN--最大区域对SPB具有更大的亲和力，并且具有更强的拯救纺锤体形成的能力。（A、D和E）含有标签的减数分裂细胞膜的一系列框架，详见图S4; 编号如图1所示。棒材，5µm。（A）rap1Δ减数分裂前期，CEN-proximal区域和SPB之间的长寿命相互作用挽救了减数分裂纺锤体缺陷。（B） 特定背景下双极性减数分裂纺锤体形成的定量。（C） 定量特定接触对双极纺锤体形成的影响，仅对接触>50分钟的细胞进行评分剪切3+-lacO/I-GFP公司，具有一个GFP焦点的细胞(n个=4）或仅当SPB处存在清晰的GFP病灶时，对核质中的两个病灶进行评分。n个是评分的细胞总数；数据经过Fisher精确检验：****，P<0.0001；***，0.0001<P<0.001；**，0.001<P<0.01。（D） 正如预期，rap1Δ没有染色质接触的细胞减数分裂纺锤体有缺陷。（E） 示例rap1Δ切口3+-lacO/I-GFP bqt1-GBP（英镑）合子。SPB处可见一个GFP病灶，大部分细胞核内可见两个GFP灶（左，红色箭头），表明未完全招募剪切3SPB的轨迹。黄色箭头表示清晰的染色质–SPB接触；白色箭头表示接触不太明显的情况，其中细胞核似乎向SPB方向伸出，但染色质标记不明显。
图8。
图8。
端粒和着丝粒促进SPB处Sad1的积累。（A） 通过减数分裂在SPB的平均Sad1-GFP信号强度在19重量减数分裂细胞，21bqt1Δ减数分裂细胞显示纺锤形缺陷，19bqt1Δ具有适当纺锤体形成的减数细胞。所示数据来自10个以上的独立实验。0 min代表MI的开始，误差线代表标准偏差。绿色阴影表示马尾SPB移动的时间。（B） Sad1-GFP/Sid4-mCherry强度比显示为A中量化的相同细胞，因为减数分裂过程中Sid4强度分布在重量和束缺陷的减数细胞（未发表的数据）。（C，左）用于实现Sad1水平大约减半的策略示意图。通过杂交形成的二倍体小时+sad1-GFP hht1-mRFP和小时−sad1-A323V-GFP hht1-mRFP是减数分裂诱导的。一旦前期马尾运动开始，将温度切换到32°C以灭活Sad1-A323V；随后的减数分裂被拍摄下来以评估纺锤体的形成。（右）显示的每个基因型的10个减数分裂细胞的Sad1-GFP强度随时间变化与心肌梗死发病相关。黄色阴影表示在25°C下拍摄的时间点；随后的时间点为32°C。（D和E）当温度切换到32°C时，Sad1-GFP/Sad1A323V-GFP减数分裂细胞的一系列框架显示SPB问题。棒材：（黑色）5µm；（灰色）1µm。（F） 所示菌株中Sad1-mCherry强度水平的定量。每个基因型都有10个以上的减数分裂细胞。
图9。
图9。
着丝粒-端粒互换性促进减数分裂纺锤体形成。减数分裂进程由左向右表示。（A） 在重量减数分裂细胞，端粒向SPB的移动促进了Sad1（黄星）或围绕Sad1的NM的修饰，反过来促进了Sad 1的积累并确保了双极纺锤体的形成。（B） 在bqtΔ减数分裂细胞没有染色质-SKS接触，Sad1积累失败，纺锤体成核也失败。（C） 在bqtΔ与着丝粒-SPB接触的减数分裂细胞，Sad1集中在SPB下方重量.
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