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.2015年2月9日4:26238。
doi:10.3402/jev.v4.26238。 2015年电子收集。

全身给药B16BL6衍生外泌体对小鼠血液循环的巨噬细胞依赖性清除

Takafumi Imai公司 1, 高桥由纪夫 1, 西川真也 1, 卡娜·加藤 1, Masaki Morishita先生 1, 山下隆久 1, 松本明弘 1, Chonlada Charoenviriyakul公司 1, 吉野高仓 2
附属公司

全身给药B16BL6衍生外泌体对小鼠血液循环的巨噬细胞依赖性清除

Takafumi Imai公司等。 J细胞外囊泡. .

摘要

先前使用标记有gLuc-lactadherin（一种Gaussia荧光素酶（一种报告蛋白）和lactadherin（一种外源性蛋白）的融合蛋白）的B16BL6衍生外泌体进行的研究表明，在小鼠体内静脉注射后，外泌物体迅速从体循环中消失。在本研究中，研究了静脉注射B16BL6外泌体快速清除的机制。用编码gLuc-LA的质粒DNA转染B16BL6细胞上清液，获得gLuc-LA-标记的外显体。当外显体在血清中孵育时，标记是稳定的。通过使用亲脂性荧光染料PKH26标记的B16BL6外泌体，证明PKH26标签的B16B6外泌物被肝和脾中的巨噬细胞摄取，但不被肺中的巨噬细胞所摄取，而PKH26标志的外泌物则被肺中内皮细胞摄取。随后，将gLuc-LA标记的B16BL6外泌体注射到通过注射含有氯膦酸盐的脂质体制备的巨噬细胞耗竭的小鼠中。在巨噬细胞耗竭小鼠中，静脉注射的B16BL6外泌体从血液循环中的清除速度比未经治疗的小鼠慢得多。这些结果表明，巨噬细胞在从体循环中清除静脉注射的B16BL6外泌体中起着重要作用。

关键词：高斯荧光素酶；库普弗细胞；间隙；外体；乳粘连蛋白；脾巨噬细胞。

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数字

图1
图1
gLuc-LA标记外泌体的收集。（a） 外泌体的蛋白质印迹分析。Alix和Hsp70是外体标记蛋白，分别使用Alix和Hsp70特异性抗体进行检测。1巷：gLuc-LA-标记的B16BL6外泌体。2巷：B16BL6外泌体。（b） 从用表达gLuc-LA的质粒DNA转染的B16BL6细胞收集的外泌体表面检测gLuc。gLuc-LA标记的B16BL6外显子在与抗gLuc抗体反应后用蛋白A-金纳米粒子染色。通过透射电子显微镜观察样品。白色箭头表示金纳米粒子。比例尺=100 nm。
图2
图2
血清中gLuc-LA标记外显子的稳定性。（a） gLuc-LA-标记的B16BL6外显子在37℃20%FBS/PBS缓冲液中gLuc活性稳定性的时间进程。最初的gLuc活性约为106RLU/s/10µL。（b） 37°C下gLuc-LA在4个样品的20%FBS/PBS缓冲液中的外显体标记稳定性的时间进程。
图3
图3
用PKH26标记的B16BL6外泌体的细胞摄取。（a–c）从接受PKH26标记的B16BL6外泌体（红色）的小鼠的肝脏（a）、脾脏（b）和肺（c）的冷冻切片用F4/80特异性抗体（绿色）染色。比例尺=100µm。（d） 肺冷冻切片用内皮细胞特异性凝集素（绿色）染色，该凝集素取自静脉注射PKH26标记的B16BL6外泌体（红色）的小鼠。比例尺=20µm。
图4
图4
gLuc-LA标记的B16BL6外泌体从血液循环中清除。静脉注射1.25（三角形）、2.5（方形）或5µg（圆形）剂量的来源于B16BL6细胞的gLuc-LA标记外泌体后，依次测量未治疗小鼠（开放符号）和巨噬细胞缺乏小鼠（闭合符号）血清中的gLuc活性。结果表示为4只小鼠注射剂量/mL（%ID/mL）+SD的平均值*与相同剂量未经处理的小鼠相比，p<0.05。
图5
图5
静脉注射B16BL6外泌体的流动可视化。（a，b）未经处理的小鼠（a）和巨噬细胞耗竭的小鼠（b）被给予标记为gLuc-lactadherin（gLuc-LA）的B16BL6外泌体。通过静脉团注柯来替嗪静脉注射外泌体后10、30、60和240分钟（从左到右），对标记有gLuc-LA的B16BL6细胞进行成像。（c，d）将gLuc-LA标记的外泌体静脉注射到未经治疗的小鼠（c）或氯膦酸脂质体处理的小鼠（d）后，肝脏（闭合三角形）、脾脏（交叉符号）和肺（开环）区域化学发光强度的时间进程。（c）和（d）中的结果表示为3只小鼠的平均值+SD。
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