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.2015年4月；14(2):265-73.
doi:10.1111/acel.12313。 Epub 2015年2月4日。

雷帕霉素介导的mTORC2抑制作用由FK506结合蛋白的相对表达决定

凯瑟琳·施赖伯 1, 丹尼斯·奥尔蒂斯, Emmeline C学院, 阿里安娜·C·安妮斯, 陈玉廖, 布莱恩·肯尼迪
附属公司

雷帕霉素介导的mTORC2抑制作用由FK506结合蛋白的相对表达决定

凯瑟琳·施赖伯等。 老化细胞. 2015年4月.

摘要

雷帕霉素抑制雷帕霉素（mTOR）机制靶点的机制备受关注，因为它可能与癌症生物学、衰老和其他与年龄相关的疾病相关。虽然雷帕霉素可直接急性抑制mTORC1，但只有长期服用雷帕霉素才能抑制某些细胞株或组织中的mTORC2。雷帕霉素抑制mTORC2的细胞特异性机制尚不清楚，尤其重要，因为最近在小鼠研究和人类临床试验中报告的雷帕霉素的许多负面代谢副作用都归因于对mTORC1的抑制。在此，我们确定了不同FK506结合蛋白（FKBP）的表达水平，主要是FKBP12和FKBP51，作为雷帕霉素介导的mTORC2抑制的关键决定因素。支持这一观点的是，强制减少FKBP12可将对mTORC2抑制敏感的细胞株完全转化为不敏感的细胞系，增加表达可增强mTORC1抑制。在FKBP12水平已经很低的细胞系中，进一步降低FKBP12-可完全阻断雷帕霉素对mTORC1的抑制，这表明相对FKBP-12水平对mTORC和mTORC2的抑制都至关重要，但在不同的水平上。相反，FKBP51的减少使细胞对mTORC2抑制更敏感。我们的研究结果表明，FKBP12和FKBP51的表达是决定细胞系或组织对雷帕霉素反应性的限速因子。这些发现对治疗特定疾病，包括神经退行性变和癌症，以及针对一般衰老具有指导意义。

关键词：FKBP；衰老；mTOR；雷帕霉素。

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数字

图1
图1
雷帕霉素对不同细胞系中的mTORC2有不同的抑制作用。PC3、HeLa、HEK 293T、H460或C2C12细胞用100 n米雷帕霉素1或24小时。通过Western blot分析检测特异性mTORC1（P-S6K T389，P-S6 S240/244）（A）和mTORC2（P-Akt S473，P-NDRG1 T346）底物（B）的磷酸化。每个细胞系对雷帕霉素抑制mTORC2的反应性被量化（C）。雷帕霉素对PC3、HeLa、HEK 293T、H460和C2C12细胞中mTORC1底物Rictor的磷酸化也有类似程度的抑制作用（D）。
图2
图2
FKBP12/FKBP51比率决定了细胞对雷帕霉素抑制mTORC2的反应性。在PC3、HeLa、H460、HEK 293T、C2C12和MEFs中检测FKBP12、25、51和52的表达（A）。从每个细胞系（B）定量FKBP12与FKBP51的比率。绘制了每个细胞系对mTORC2抑制的反应性与FKBP12/51比率之间的相关性（C）。绘制了每个细胞系对mTORC1抑制的反应性与FKBP12/51比率之间的相关性（D）。
图3
图3
敲除FKBP12可削弱雷帕霉素对mTORC2的抑制作用。将针对FBKP12的shRNA构建物转染到PC3、HeLa或HEK 293T细胞（A）。用雷帕霉素处理表达FKBP12 shRNA 1、2或3的PC3细胞24 h，通过Western blot分析（B）和定量（C）检测降低FKBP1水平对mTORC1信号（P-S6 S240/244）和mTORC2信号（P-Akt S473和P-NDRG1 T346）的影响。在存在或不存在FKBP12 shRNA的PC3细胞中进行mTOR免疫沉淀，并对mTOR、Rictor和Raptor（D）进行Western blot分析。用雷帕霉素处理表达FKBP12 shRNA 1、2或3的HeLa（E）或HEK 293T细胞（F）24 h，通过Western blot分析检测降低FKBP12mTORC1信号（P-S6K T389和P-S6 S240/244）和mTORC2信号（P-Akt S473）的作用。结果是三个独立实验±SEM的平均值。
图4
图4
过表达FKBP12使HEK 293T细胞对雷帕霉素抑制mTORC2敏感。将FKBP12慢病毒构建物导入表达FKBP12-shRNA的PC3细胞（A）。在有或无FKBP12构建物的情况下表达shRNA构建物的PC3细胞用雷帕霉素处理24 h，并用Western blot分析（B）检测mTORC1活性（P-S6 S240/244）和mTORC2活性（P-Akt S473）。将FKBP12慢病毒构建物转染到HEK 293T细胞中，用或不用雷帕霉素处理细胞24小时。Western blot分析检测mTORC1活性（P-S6 S240/244）和mTORC2活性（P-Akt S473）（C）并量化（D）。在HEK 293T细胞+/−FKBP12构建体中分析FKBP12的表达（E）。结果是四个独立实验±SEM的平均值。显示了统计显著性(*P（P）与未经治疗的对照组相比<0.001）。
图5
图5
敲除FKBP51使细胞株对mTORC2抑制更敏感。将针对FBKP51的shRNA构建物转染到PC3、HeLa或HEK 293T细胞（A）。用雷帕霉素处理表达shRNA 1、2或3的PC3细胞24 h，通过Western blot分析（B）和定量（C）检测敲除FKBP51对mTORC1信号（P-S6 S240/244）和mTORC2信号（P-Akt S473和P-NDRG1 T346）的影响。野生型，FKBP51型−/−，或FKBP52型−/−用雷帕霉素处理MEF 24 h，通过Western blot分析和定量（D）评估MEF对mTORC1（P-S6 S240/244）和mTORC2（P-Akt S473）的反应性。结果是五个独立实验±SEM的平均值。使用抗mTOR抗体对野生型或FKBP51型−/−MEF公司。然后对免疫沉淀样品进行mTOR、Rictor或Raptor（E）免疫印迹。对输入样本进行mTOR、Raptor、Rictor、P-S6（S240/244）或S6（F）分析。结果是3-5个独立实验±SEM的平均值。显示了统计显著性(*P（P）与未经治疗的对照组相比<0.001）。
图6
图6
小鼠组织中FKBP的表达与雷帕霉素抑制mTORC2的反应性相关。小鼠IP注射雷帕霉素（8 mg kg−1)每隔一天，持续3周。小鼠隔夜禁食并注射胰岛素15分钟，并检查每个组织对雷帕霉素抑制mTORC1（P-S6 S240/244）或mTORC2（P-Akt S473）的反应性。心脏（A）和肝脏（B）对mTORC2抑制反应。其他组织的完整特征如图S3所示，并进行了量化（C）。通过Western blot分析（D）评估FKBPs在小鼠组织中的表达。在不同的组织采集条件下评估FKBP12/FKBP51和各组织中mTORC2抑制的相关性：禁食6小时（E）或隔夜禁食后注射15分钟胰岛素（F）。结果是每队列4只小鼠的平均值±SEM。
图7
图7
FKBP51与FKBP12竞争急性抑制mTORC1，而FKBP12则需要长期抑制mTORC 1和mTORC2。
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参考文献

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