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。2015年3月26日；519(7544):477-81.
doi:10.1038/nature14107。 Epub 2015年1月7日。

SLC38A9是控制mTORC1的溶酶体氨基酸传感机械的一个组件

曼努埃尔·雷布萨曼 1, 洛伦娜·波奇尼 2, 塔拉斯·斯塔西克 三, 马里亚纳·E·G·德·阿劳霍 三, 米歇尔·加卢奇奥 2, 理查德·坎达萨米 1, 贝伦德·斯奈德 1, 阿斯特里德·福斯特 1, 埃琳娜·卢达舍夫斯卡娅 1, 马努埃拉·布鲁克纳 1, 斯特凡妮亚·斯科佐尼 1, Przemyslaw A Filipek公司 三, 基里安V M胡贝尔 1, 约翰内斯·比根赞恩（Johannes W Bigenzahn） 1, 莱昂哈德·海因茨 1, 克劳迪娜·卡夫 4, 凯琳·本内特 1, 塞萨尔·英迪维尔 2, 卢卡斯·A·胡贝尔 三, 朱利奥·Superti-Furga 1
附属公司

SLC38A9是控制mTORC1的溶酶体氨基酸传感机械的一个组件

曼努埃尔·雷布萨曼等。 自然。 。

摘要

细胞生长和增殖与营养物质的可用性密切相关。雷帕霉素复合物1（mTORC1）的机制靶点整合了生长因子、能量水平、葡萄糖和氨基酸的存在，以调节代谢状态和细胞反应。mTORC1在溶酶体表面被RAG GTP酶和Ragulator复合物激活，其机制尚不完全清楚，可监测溶酶体腔中的氨基酸可用性，并涉及液泡H（+）-ATP酶。在这里，我们将溶质载体家族38（SLC38A9）的未表征的人类成员9描述为能够进行氨基酸转运的溶酶体膜驻留蛋白。广泛的功能蛋白质组分析确定SLC38A9是Ragulator-RAG GTPases机制的组成部分。SLC38A9功能的增强使细胞对氨基酸的提取具有抵抗力，而SLC38A表达的缺失则会损害氨基酸诱导的mTORC1激活。因此，SLC38A9是控制mTOR激活的氨基酸传感机械的物理和功能部件。

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数字

扩展数据1
扩展数据1。氨基酸转运蛋白家族SLC成员的表达
a、，RNAseq监测的HEK293和K562细胞中强烈表达的属于氨基酸转运蛋白家族的SLC表。根据表达水平对两个细胞系中表达（FPKM>0.5）的氨基酸转运蛋白家族（SLC1、6、7、16、17、18、32、36、38和43家族）的SLC成员进行排序，显示前十名。PubMed条目的数量是通过查询GeneSymbol（24第2013年10月）。b、，SLC32、SLC36和SLC38家族成员在HEK293和K562细胞中的表达。
扩展数据2
扩展数据2。SLC38A9的生化和功能表征
a-b，如有指示，用标记的SLC38A9构建物（+）或空载体（−）转染HEK293T细胞。细胞裂解物未经处理（Untr.）或在37°C下在有或无PNGase的条件下孵育1小时，并通过免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）c（c），通过自动显微镜和图像分析测量短发夹（shRNA）介导击倒GFP（对照，黑线虚线）或SLC38A9（灰线）后HEK293T细胞的细胞大小。通过图像分析和机器学习选择稀疏细胞和间期细胞，并使用细胞核直径作为细胞大小的稳健代理。分别显示了2400个和4165个细胞的平滑分布。d日，用慢病毒编码的shRNA抗SLC38A9或GFP转导的HEK293T细胞的细胞增殖测量。105每24小时播种一次细胞并计数。三次的平均值±s.d。结果代表了两个独立实验（n=2）。e-f、，如有指示，用标记的SLC38A9转染HEK293T细胞。制备细胞裂解物，未经处理（Untr.），或在37°C下，在有或无PNGase的情况下孵育1小时，并通过免疫印迹进行分析。如有指示，在PNGase处理后，将细胞裂解物在95°C下煮沸5分钟。g-h，来自小鼠NIH/3T3的裂解物(克)或原始264.7(小时)用所示抗体对细胞进行免疫沉淀，用PNGase处理并用免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）。<：SLC38A9；*：非特异性带。
扩展数据3
扩展数据3。SLC38A9蛋白质组分析：诱饵定位和结果
a、，HEK293 Flp-in-TREx细胞中DAPI染色细胞核的单通道和合并共聚焦显微镜图像，以及针对HA标记的SLC38A9和内源性溶酶体标记LAMP1（顶面板）和LAMP2（中面板）的间接免疫荧光，以及非诱导和仅次级抗体对照（底面板）。比例尺，10μm。图中显示了SLC38A9（绿色）和LAMP1、LAMP2或二级抗体控制（红色）沿着相应合并通道图像中所示横截面线的强度分布。b条，背景上方HA-SLC38A9信号的量化（虚线一)与LAMP1、LAMP2或仅二级抗体阳性区域共定位。显示了至少两个图像的平均值和标准差，分别分析了22、34和27个细胞的共定位。c、，用强力霉素（Dox）处理或不处理诱导表达SLC38A9的TREx细胞中的HEK293 Flp-In 24小时。如有指示，用PNGase处理细胞裂解物并进行免疫印迹分析。d中，表格视图总结了SLC38A9、SLC38A1、SLC39A2和SLC36A1的蛋白质组分析。TAP–LC-MS/MS鉴定的SLC38A9相互作用物与其他转运体进行的相同分析的比较。显示了光谱计数（Sp.c.，生物复制平均值）和序列覆盖率（Sq.c.，百分比，生物复制的平均值）。所示数据基于每种条件下的两个独立实验（n=2），每个实验在两个技术复制中进行分析。
扩展数据4
扩展数据4。SLC38A9定位于晚期内体/溶酶体室
a-h、，用指示的链球菌HA标记的SLC38A9构建物转染HeLa细胞。显示了HA标记的SLC38A9（红色）和内源性溶酶体标记LAMP1（绿色）的间接免疫荧光的合并和单通道共焦显微镜图像。显示了具有代表性的单元格。比例尺，10μm。
扩展数据5
扩展数据5。SLC38A9是Ragulator/RAG GTPase复合物的组成部分
a、，核心Ragulator/RAG GTPase网络和检测到的已发布交互作用物的光谱计数（Spec.计数，生物复制平均值）和序列覆盖率（Seq.cov.，百分比，生物复制的平均值）的表格视图。所示数据基于每种条件下的两个独立实验（n=2），并在两个技术复制中进行了分析b至cLAMTOR1、3、4和5中检测到的SLC38A9肽(b条)或SLC38A9中(c（c）)TAP-MS/MS分析绘制在SLC38A9序列上，并以粗体突出显示。跨膜螺旋以浅棕色突出显示。潜在的胰蛋白酶裂解位点为红色。
扩展数据6
扩展数据6。SLC38A9的细胞质N末端区域通过进化保守基序结合Ragulator/RAG GTPase复合体
a、，人类、小鼠、大鼠N端细胞质区域（氨基酸1-112）的序列比对，爪蟾和斑马鱼SLC38A9。重点介绍了被选择缺失的氨基酸和被丙氨酸取代的基序。黑色和灰色阴影分别表示>60%的氨基酸序列同一性和相似性。b-c，用标记的SLC38A9构建物转染HEK293T细胞。免疫印迹分析抗-HA免疫沉淀物和细胞提取物。SLC38A9突变结构体标记有编码氨基酸的数量(b条)或氨基酸基序被丙氨酸取代(c（c）)。结果代表了两个独立实验（n=2）。
扩展数据7
扩展数据7。SLC38A9介导的氨基酸在蛋白质脂质体中的转运特性
a、，SLC38A9的纯化。车道表示空载矢量控制，SLC38A9表示为大肠杆菌并在Ni相关色谱上纯化。显示了使用抗-His抗体或抗SLC38A9的相同组分的免疫印迹。b、，SLC38A9在蛋白质脂质体中的定位。纯化的His-SLC38A9蛋白质或用SLC38A重建的蛋白质脂质体在37°C下在有或无1U凝血酶的条件下培养过夜。然后用SDS溶解蛋白脂质体并通过免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）c、，SLC38A9在用纯化蛋白质部分重组的蛋白质脂质体中摄取谷氨酰胺的时间过程。10μM的吸收[三H] 在存在指示的脂质体内钠浓度的情况下，在不同的时间间隔测量谷氨酰胺。通过减去与用空载体部分重组的蛋白脂质体相关的放射性来计算转运。数值表示三个独立实验（n=3）得出的比输运平均值±标准差d中，用纯化的SLC38A9野生型或N128A突变蛋白重组的蛋白脂质体中谷氨酰胺摄取的时间过程。数值表示3个独立实验（n=3）得出的比输送平均值±标准差。通过Student t检验评估显著性(*P（P）< 0.01). 蛋白质脂质体重组纯化蛋白的免疫印迹分析e（电子）.pH值对复原SLC38A9的影响。在指定的pH值下进行重组和转运分析。结果是三个不同实验（n=3）的比转运率±s.d.的平均值。f、，抑制[三H] -蛋白质脂质体中谷氨酰胺的摄取。添加1 mM MeAIB（α-（甲胺基）异丁酸）和10μM[三H] -谷氨酰胺。在60分钟时测量转运。数值表示三个独立实验（n=3）中相对于对照组（无添加抑制剂）±标准差的剩余活性百分比平均值。
扩展数据8
扩展数据8。RAGB/RAGC异二聚体与SLC38A9的核苷酸载量/构象依赖性相互作用
用标记的RAG GTPases突变构建物或空载体（−）的指示组合转染HEK293T细胞。用PNGase处理抗-HA免疫沉淀物和细胞提取物并进行免疫印迹分析。W： 野生型；75：S75N；120:Q120L；99:Q99L；54:T54N。结果代表了两个独立实验（n=2）。
扩展数据9
扩展数据9。SLC38A9的稳定表达介导氨基酸饥饿时mTORC1的持续激活
a。将稳定表达SLC38A9-或METAP2-的HEK293T细胞在不含氨基酸和血清的培养基中饥饿指定时间。细胞裂解物通过免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）b。稳定表达EGFP-LC3B和SLC38A9或METAP2的HEK293T细胞GFP通道中的代表性图像饥饿120分钟（参见图4B）。比例尺，40μmc。将稳定表达TFEB-STHA和SLC38A9或METAP2的HEK293T细胞饥饿指定时间。用免疫印迹法分析细胞质和细胞核组分。结果代表了两个独立实验（n=2）。d日。稳定表达所示SLC38A9结构的HEK293T细胞的免疫印迹分析。e（电子）将稳定表达HEK293T的SLC38A9（S）-或METAP2（M）-饥饿50分钟，然后用氨基酸刺激20分钟。如有指示，在两个培养时间内用ConcanamycinA（5μM）或DMSO处理细胞。用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。结果代表了两个独立实验（n=2）f。用DMSO（D）、ConcanamycinA（C，5μM）或Torin 1（T，250 nM）处理稳定表达HEK293T的SLC38A9（S）或METAP2（M）30分钟，然后在抑制剂存在的情况下饥饿指定时间。细胞裂解物通过免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）。
扩展数据10
扩展数据10。氨基酸诱导的mTORC1激活需要SLC38A9的表达，并且不受饥饿的影响
一用靶向SLC38A9（SLC）、LAMTOR1（LT1）或非靶向对照（CNTR）的siRNA转染HeLa。72小时后，细胞在无氨基酸和血清的培养基中饥饿50分钟，然后在胰岛素（1μM）存在下用氨基酸刺激。细胞裂解物通过免疫印迹分析。结果代表了三个独立实验（n=3）。b-c，将HEK293T细胞饥饿所指示的时间。通过定量PCR分析SLC38A9的表达(b条)和免疫印迹(c（c）)。在(b）显示了三份技术样品的平均值±标准差。结果代表了两个独立实验（n=2）<：SLC38A9；*：非特异性带。
图1
图1。SLC38A9是控制mTORC1的氨基酸感应机械的溶酶体成分
a、，通过TAP–LC-MS/MS鉴定SLC38A9的相互作用体。所示数据基于两个独立实验（n=2），每个实验在两个技术复制中进行分析。b至g，转染有所示标记构建物或空载体（−）的HEK293T细胞的裂解物(b、 c，克)、控制（空载体或shGFP）或shSLC38A9转导的HEK293T(d日)和赫拉(e（电子）)或K562(如果)细胞进行免疫沉淀。PNGas处理的免疫沉淀物（IP）和蛋白提取物（XT）用所示抗体进行免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）<：ST-HA-SLC38A9；*：非特异性带h-j，转染标记SLC38A9构建物并用抗HA和LAMP1免疫染色的HeLa细胞的共焦显微镜图像(小时)、EEA1(我)或吉安丁(j)抗体。显示了具有代表性的单元格。比例尺，10μm。
图2
图2。SLC38A9是Ragulator/RAG GTPases机械的组成部分
a、，通过TAP–LC-MS/MS鉴定了LAMTOR1、LAMTOR3、LAMTOR 4、LAMTOR5、RAGA和RAGC的相互作用体。显示了与所有诱饵蛋白相互作用的蛋白质，添加了RAGC下拉中未检测到的RAGD。指出了之前公布的检测到的Ragulator/RAG GTPases复合物的相互作用物。所示数据基于每个条件（n=2）的两个独立实验，每个实验在两个技术复制中进行分析b-e、，HEK293T细胞转染有标记的构建物或空载体（−）。免疫沉淀物和细胞提取物用PNGase处理并进行免疫印迹分析。SLC38A9突变结构体标记有编码氨基酸的数量(d日)或氨基酸基序被丙氨酸取代(e（电子）)。结果代表了两个独立的实验（n=2）。
图3
图3。SLC38A9以核苷酸负载和氨基酸敏感性方式运输氨基酸并与RAG GTPases相互作用
一，时间进程[三H] -用纯化的SLC38A9或对照空载体重组的蛋白脂质体中谷氨酰胺的摄取。数值表示八个不同实验（n=8）的比输送平均值±标准差。b、，氨基酸抑制[三H] -蛋白质脂质体中谷氨酰胺的摄取。数值表示三个独立实验（n=3）中相对于对照组（无添加竞争对手）±标准偏差的剩余活性平均值。c（c），吸收指示的[三H] 蛋白质脂质体中SLC38A9标记的氨基酸。数值表示三个独立实验（n=3）中在同一实验中测量到的谷氨酰胺转运百分比平均值±标准差。d中，用SLC38A9重建的蛋白脂质体谷氨酰胺流出的时间过程。数值表示三个独立实验（n=3）得出的比输送平均值±标准差。e、，用标记的RAG GTPases突变构建物或空载体（−）的指示组合转染HEK293T细胞。PNGas处理的免疫沉淀物和细胞提取物通过免疫印迹分析。W： 野生型；66:Q66L；21:T21N；75：S75N；120:Q120L。f-g（胎龄）将稳定表达所示结构的HEK293T细胞饥饿氨基酸和血清50分钟（AA starv+），并用氨基酸刺激20分钟（AA stim+）。免疫印迹分析免疫沉淀物和细胞提取物。在克显示了两个生物复制的结果。*：IgG轻链。结果代表两个(e（电子）-如果，n=2）或三个(克，n=3）独立实验。在a-c公司通过Student t检验估计显著性(*P（P）<0.01或**P（P）< 0.001)
图4
图4。SLC38A9是氨基酸激活mTORC1所需的正调节因子
a、，稳定表达野生型FLAG-SLC38A9-或FLAG-METAP2的HEK293T细胞在无氨基酸和血清的培养基中饥饿30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物b、，将稳定表达EGFP-LC3B和SLC38A9或METAP2的HEK293T细胞饥饿指定时间。通过图像分析定量LC3B阳性自噬体。将数据标准化为细胞大小，并相对于拟合的METAP2最大值绘制。至少三个重复井的平均值±s.d。c。稳定表达所示未标记SLC38A9结构的HEK293T细胞按照一。d-电子，用抗SLC38A9或GFP的慢病毒编码shRNA转导的HEK293T细胞饥饿50分钟，然后用氨基酸刺激(d日)或环己酰亚胺(e（电子），25μg/ml）10或20分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物。如果用靶向SLC38A9、LAMTOR1或非靶向对照的siRNA转染HEK293T。72小时后，细胞按d日.英寸(电子-传真降低)细胞裂解物用PNGase处理;*：非特异性带。克，SLC38A9在氨基酸诱导的mTORC1激活中的功能示意图模型。结果具有代表性(a-e公司，n=2）或三个(如果)独立实验（n=3）。
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主要文本参考

    1. Dibble CC，Manning BD。mTORC1的信号整合协调营养输入和生物合成输出。自然细胞生物学。2013;15:555–564. doi:10.1038/ncb2763。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Laplante M，Sabatini DM。生长控制和疾病中的mTOR信号传导。单元格。2012;149:274–293. doi:10.1016/j.cell.2012.03.017。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cornu M、Albert V、Hall MN.mTOR在衰老、新陈代谢和癌症中的应用。遗传学与发展的当前观点。2013;23:53–62. doi:10.1016/j.gde.2012.12.005。-公共医学
    1. Kim E，Goraksha-Hicks P，Li L，Neufeld TP，Guan KL.Rag GTPases在营养反应中对TORC1的调节。自然细胞生物学。2008;10:935–945. doi:10.1038/ncb1753。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Sancak Y等人Rag GTP酶结合猛禽并介导mTORC1的氨基酸信号传导。科学。2008;320:1496–1501. doi:10.1126/science.1157535。-项目管理咨询公司-公共医学

方法参考

    1. Varjosalo M等人。通过标准化AP-MS进行大规模人类蛋白复合物分析的实验室间再现性。自然方法。2013;10:307–314. doi:10.1038/nmeth.2400。-公共医学
    1. Giambruno R等人。转录因子复合物蛋白质组分析的亲和纯化策略。蛋白质组研究杂志。2013;12:4018–4027. doi:10.1021/pr4003323。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Pichlmair A等人。病毒免疫调节剂通过共同和独特的策略干扰人类分子网络。自然。2012;487:486–490。doi:10.1038/nature11289。-公共医学
    1. Colinge J、Masselot A、Giron M、Dessingy T、Magnin J.OLAV：走向高通量串联质谱数据识别。蛋白质组学。2003;3:1454–1463. doi:10.1002/pmic.200300485。-公共医学
    1. Bennett KL等。人类白内障房水的蛋白质组学分析：一维凝胶LCMS与未标记和iTRAQ（R）标记标本的二维LCMS的比较。蛋白质组学杂志。2011;74:151–166. doi:10.1016/j.jprot.2010.10.002。-公共医学

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