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。2015年1月13日；112(2):394-9.
doi:10.1073/pnas.1414056112。 Epub 2014年12月29日。

最近发现的变构抑制剂阻断转化细胞谷氨酰胺代谢的机制

Clint A Stalnecker公司 1, 斯科特·M·乌尔里奇 2, 李云兴 1, 塞卡尔·拉马钱德兰 1, 玛丽·凯特·麦克布雷耶 三, 拉尔夫·德贝拉迪尼斯 4, 理查德·塞里奥 5, 乔恩·埃里克森 1
附属公司

最近发现的变构抑制剂阻断转化细胞谷氨酰胺代谢的机制

Clint A Stalnecker公司等人。 美国国家科学院程序。 。

摘要

线粒体谷氨酰胺酶C（GAC）催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨，这是癌细胞谷氨酰胺代谢的关键步骤。最近，我们发现了一类GAC变构抑制剂，它可以抑制癌细胞生长而不影响正常细胞对应物，其先导化合物是溴代苯并菲啶酮968。这里，我们利用由致癌Dbl转化的小鼠胚胎成纤维细胞，该成纤维细胞过度激活Rho GTPases，以及（13）C-标记的谷氨酰胺和稳定同位素追踪方法，来确定968选择性地阻断满足癌细胞谷氨酰胺成瘾所需的谷氨酰胺分解增强。然后我们确定968如何抑制GAC的催化活性。首先，我们开发了一种FRET分析，以检查968对GAC进行酶激活所需的二聚体到四聚体转换能力的影响。接下来，我们将演示与GAC相连的报告组的荧光如何直接读出968和相关化合物与酶的结合。通过将这些荧光分析与新开发的捕获于单体或二聚体状态的GAC突变体相结合，我们表明968对单体GAC具有最高的亲和力，968与GAC单体的剂量依赖性结合直接匹配其对酶活性和细胞转化的剂量依赖抑制。总之，这些发现强调了四聚体形成作为GAC激活机制的要求，并为一类不同的变构GAC抑制剂如何影响转化细胞的代谢程序提供了新的线索。

关键词：FRET；Rho GTPases；苯并菲；谷氨酰胺酶；谷氨酰胺水解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
968抑制了Dbl诱导的转化和增加的谷氨酸分解。(A类)在用抗肌动蛋白（红色）和抗HA（绿色）抗体诱导Dbl诱导的MEF 24小时后（+Dox）和（−Dox）进行荧光染色。(B类)Dbl的表达赋予MEF形成病灶的能力，而用10μM 968治疗可以阻断这种能力。(C类)图表显示13来自[U的C富集-13C] -谷氨酰胺转化为TCA循环中间产物，其中突出显示了Dbl下游的GAC活化。13碳原子显示为黑色填充圆圈12C-碳作为充满光的圆圈。(D类)谷氨酰胺衍生代谢物（谷氨酸M+5、富马酸M+4、苹果酸M+4、柠檬酸M+4）归一化为13对不表达Dbl的MEFs观察到的C富集。对968的治疗进行了比较，968是一种效力较低的类似物27（见图3D类分子结构）和未经处理的细胞。条形代表三次测定的平均值（±SD）。P（P）值由学生确定t吨测试(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005).
图2。
图2。
实时荧光分析检测GAC四聚体的形成。(A类)FRET分析的示意图。(B类)25 nM 488-GAC（供体）荧光在以剂量依赖的方式添加QSY9-GAC（受体）后熄灭，并通过添加10倍多余的未标记GAC而反转。(C类)随着QSY9-GAC量的增加，25 nM 488-GAC的滴定产生的FRET(○) 覆盖GAC的浓度依赖性体外激活(●). FRET数据符合二次结合等温线。点表示三个独立实验的平均值±SD。(D类)将越来越多的BPTES添加到25 nM 488-GAC和25 nM QSY9-GAC中，以检查抑制剂对GAC四聚体形成的影响。添加10倍多余的未标记GAC，试图逆转四聚体的形成。(E类)968诱导488-GAC荧光的剂量依赖性猝灭，这与添加QSY9-GAC诱导的猝灭不同。(F类)在没有QSY9-GAC的情况下，添加不同浓度的968至10 nM 488-GAC时的荧光猝灭。
图3。
图3。
开发实时968结合和抑制分析。(A类)实时968结合和抑制分析的示意图模型。监测488-GAC荧光猝灭作为968结合的读数，通过向含有标记GAC、10单位谷氨酸脱氢酶（GDH）和2 mM NAD的分析培养基中添加20 mM谷氨酰胺和50 mM磷酸盐生成NADH荧光来监测酶活性+. (B类)在指定时间添加20μM 968（–）、10μM BPTES（•••）或DMSO（-），监测10 nM 488-GAC（520-nM发射，绿色曲线）的荧光。同时，在120秒添加20 mM谷氨酰胺和50 mM磷酸盐后，监测NADH荧光（460-nm发射，蓝色曲线）(C类)实时968结合和抑制试验适用于96 well板格式，显示10 nM 488-GAC和10 nM WT未标记GAC的重叠抑制和荧光猝灭曲线。数据点是三个独立实验的平均值±标准差。实线显示了与K的结合等温线的半对数图D类=3微米。(D类)实时结合和抑制分析中使用的968和968-like类似物的结构。(E类)绘制的IC50抑制数据和测量K的（±SD）值D类968个类似物代表组的荧光猝灭数据的（±SD）值（如D类). 化合物a–i对应于中所示的字母名称D类从抑制数据和猝灭数据中获得的值适用于生物分子相互作用的配体结合方程。该线表示具有以下值的线性回归拟合(R（右）2=0.92，斜率=1.10）。
图4。
图4。
检测968与单体和二聚体GAC突变体的结合。(A类)GAC四聚体（人类亚型）与BPTES和谷氨酸盐（PDB 3UO9）复合物的晶体结构，建议的968结合囊由指向C末端单体-单体界面的箭头指示。插图突出关键单体单体(上部)和二聚体(下部)触点，带有相应的人和鼠GAC亚型残基编号(B类)WT GAC（红色）、D391K-GAC（蓝色）和K316E-D391K-R459E-GAC（绿色）的多角度光散射剖面，250μg（每个），其中实线表示通过监测折射率（R.I.）对每个物种进行洗脱，虚线表示当时洗脱物种的计算分子量。酶的单体、二聚体和四聚体形式的分子量参考线分别包括在58、116和232 kDa。(C类)将200 nM WT QSY9-标记的GAC（红色）、二聚体QSY9-GAC（D391K）（蓝色）和单体QSY8-GAC（K316E、D391K、R459E）（绿色）添加到20 nM WT488-标记的GA中，进行FRET分析。(D类)968结合，通过其猝灭WT 488标记的GAC、二聚体488-GAC（D391K）和单体GAC（K316E、D391K和R459E）的荧光来监测（每个样品中的总单体为10nM）。数据点代表三个独立实验的平均值（±SD），如图3所示C类. (E类)50 nM的体外抑制曲线(●) 和5 nM WT GAC(○) 以968的浓度进行预培养。数据点代表三个独立实验的平均值（±SD），并符合逻辑四参数曲线。重叠是968对Dbl诱导的病灶形成（三角形）的剂量依赖性抑制。
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