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。2015年1月6日；112（1）：E21-9。
doi:10.1073/pnas.1417015112。 Epub 2014年12月18日。

谷氨酰胺酶和Hsp90联合抑制对mTORC1驱动的肿瘤细胞的合成杀伤作用

李静 1, 阿尔弗雷多·西比 1, 孙阳 2, 格雷戈里·霍夫曼 1, 李成钢 2, 埃里克·张 2, 简·J·余 2, 约翰·布莱尼斯 三
附属公司

谷氨酰胺酶和Hsp90联合抑制对mTORC1驱动的肿瘤细胞的合成杀伤作用

李静等人。 美国国家科学院程序。 。

缩回

摘要

雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点整合来自生长因子、营养素和细胞能量状态的多种信号，以控制广泛的代谢过程，包括mRNA生物生成；蛋白质、核苷酸和脂质合成；和自噬。mTORC1通路的去调节作用见于癌症以及遗传性疾病，如结节性硬化综合征（TSC）和散发性淋巴管平滑肌瘤病。最近的研究表明，mTORC1抑制剂雷帕霉素及其类似物通常抑制增殖而不是诱导凋亡。因此，使用替代策略来诱导具有活化mTORC1的细胞死亡是至关重要的。在本研究中，小分子筛选显示，谷氨酰胺酶（GLS）和热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂的组合选择性地触发TSC2-缺陷细胞的死亡。在机械水平上，与野生型细胞不同，TSC1/2缺陷细胞中mTORC1驱动的高翻译率使这些细胞对内质网（ER）应激敏感。因此，抑制Hsp90可促进未折叠蛋白的积累和内质网应激。当通过GLS抑制细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的耗竭将蛋白毒性应激与氧化应激结合时，在mTORC1信号激活的细胞中观察到急性细胞死亡。这项研究表明，这种联合策略可能有潜力发展成为治疗mTORC1驱动的肿瘤的治疗用途。

关键词：热休克蛋白90；谷氨酰胺酶；抑制剂；mTORC1；合成致命性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
靶向小分子筛选确定GLS抑制致敏Tsc2型−/−MEF对Hsp90的抑制作用。(A类)PERK和S6K1的磷孢子强度Tsc2型−/−如图所示，用增加浓度的17AAG处理MEF 72小时。使用LiCOR-Odyssey红外成像系统计算强度。显示了平均值；误差条代表SEM(n个> 3). (B类)识别为敏化的分子Tsc2型−/−至17AAG（0.3μM），二倍截止。(C类)图中显示了参与谷氨酰胺补充和谷胱甘肽生成的酶以及本研究中使用的抑制剂（更多详细信息请参阅正文）。(D类)谷氨酰胺消耗Tsc2型−/−用二甲基亚砜、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）或BPTES加17AAG治疗72小时后的MEF。显示平均值；误差条代表SEM(n个> 3). (E类)细胞活力Tsc2型−/−使用CellTiter-Glo的MEF。相对发光测量单位：Tsc2型−/−如图所示，在添加或不添加BPTES的17AAG浓度增加的情况下，72小时后出现MEF。显示平均值；误差条代表SEM(n个> 3).
图2。
图2。
GLS和Hsp90的联合抑制导致细胞存活率下降和形态学改变Tsc2型−/−MEF公司。(A类)Tsc2型−/−如图所示，用DMSO、17AAG（0.5μM）、雷帕霉素（20 ng/mL）和BPTES（10μM）处理MEFs 48和72小时。使用相位显微镜观察细胞活力。(B类)透射电子显微镜（TEM）图像（9300×1.4×）Tsc2型−/−用二甲基亚砜、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）或BPTES加17AAG治疗24小时后的MEF。黑色箭头表示线粒体，星号表示脂滴。(C类)TEM图像（23000×1.4×）显示Tsc2型−/−联合使用BPTES（10μM）和17AAG（0.5μM）处理MEF。(D类)TEM图像描绘了一个溶酶体（L）和晚期内体（LE）Tsc2型−/−联合使用BPTES（10μM）和17AAG（0.5μM）处理MEF。
图3。
图3。
抑制谷氨酰胺补体和Hsp90可导致大鼠脑内细胞凋亡Tsc2型−/−细胞。(A类)细胞死亡Tsc2型−/−(左侧)和Tsc2型–重量(赖特)通过碘化丙啶（PI）排除试验，测量在添加或不添加BPTES（10μM）的17AAG浓度下治疗72小时后的MEF。显示平均值；误差条代表SEM(n个>3）。(B类)蛋白裂解PARP、P-S6K1、4E-BP1和α-微管蛋白的免疫印迹分析坦桑尼亚先令2−/−用所示化合物处理MEF 24小时(C类)mTORC1通路下游靶点的免疫印迹分析Tsc2型−/−在指定的时间点，用雷帕霉素（20 ng/mL）、17AAG（1μM）或两者的组合处理MEF。(D类)LC3B、p62、P-S6K1、S6K1，P-S6和GAPDH的免疫印迹分析Tsc2型−/−MEF被视为C类。
图4。
图4。
GDH抑制不会使细胞对Hsp90抑制敏感。(A类)细胞死亡Tsc2型−/−用所示化合物处理MEF 72小时。显示平均值；误差条代表SEM(n个> 3). (B类)蛋白裂解PARP和α-微管蛋白的免疫印迹分析坦桑尼亚先令2−/−MEF被视为A类持续24小时(C类)细胞内谷氨酸水平Tsc2型−/−用BPTES（10μM）处理MEF 72小时。以靶向GLS的siRNA作为对照。显示了平均值；误差条代表SEM(n个= 3). (D类)Tsc2型−/−用DMSO、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）和谷氨酸（4 mM）处理MEF 48小时。使用相位显微镜观察细胞活力。(E类和F类)蛋白裂解PARP和α-微管蛋白的免疫印迹分析坦桑尼亚联合共和国2−/−用所示化合物处理MEF 24小时。所用化合物的浓度为BPTES（10μM）、谷氨酸（4 mM）、丙酮酸（1 mM）和DM-αKG（7 mM）。
图5。
图5。
氧化还原失衡是BPTES和17AAG诱导细胞凋亡的原因。(A类)图中显示了参与谷胱甘肽生物合成的酶和本研究中使用的抑制剂（更多详细信息见正文）。(B类)细胞内谷胱甘肽水平在Tsc2型−/−用DMSO、BPTES（10μM）、17AAG（0.5μM）或BPTES加17AAG处理MEF 48小时(n个= 3). (C类)细胞内ROS水平在Tsc2型−/−MEF被视为B类(n个= 3). (D类)Tsc2型−/−用DMSO、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）和NAC（10 mM）处理MEF 72 h。使用相位显微镜观察细胞活力。(E类)蛋白裂解PARP和α-微管蛋白的免疫印迹分析坦桑尼亚先令2−/−如图所示，用DMSO、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）和维生素C（100μM）处理24小时的MEFs。(F类)细胞死亡Tsc2型−/−用DMSO、17AAG（0.5μM）、BPTES（10μM）和GSH-MEE（2 mM）处理MEF 72 h。显示平均值；误差条代表SEM(n个= 3). (G公司)细胞内PARP、p-eIF2α和GAPDH裂解的免疫印迹分析坦桑尼亚先令2−/−MEF处理24小时，如F类（1-5车道）或BSO（1 mM）结合17AAG浓度增加（6-9车道）。
图6。
图6。
GLS和Hsp90的双重抑制导致异种移植瘤发展的逆转。(A类)雌性CB17-scid小鼠接种ELT3-luciferase细胞s.c。小鼠用载体、BPTES、17AAG或BPTES和17AAG联合治疗3周。每周测量体重。(B类)每周用数字卡尺测量肿瘤面积。左边的年axis表示药物治疗前肿瘤大小与基线测量值的相对倍增长。(C类和D类)每周记录并量化异种移植瘤的生物发光强度。左边的年axis表示药物治疗前肿瘤相对生长量与基线定量。(E类)用载体、BPTES、17AAG或联合BPTES和17AAG治疗的小鼠肿瘤中细胞增殖标记物PCNA的免疫组织化学染色的代表性图像。PCNA核免疫反应阳性细胞的百分比从每段4到6个随机字段进行评分**P（P）<0.01，学生t吨测试。(F类)TUNEL标记的肿瘤切片的代表性图像，TUNEL是一种检测凋亡细胞死亡的方法，用于检测小鼠治疗载体、BPTES、17AAG或BPTES加17AAG的肿瘤。
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