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SRC激酶抑制剂削弱抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤活性

马格达莱娜·维尼亚尔斯卡等。 MAbs公司. 2014.

摘要

SRC家族激酶（SFKs）抑制剂单独使用或与抗CD20单克隆抗体（mAbs）联合使用治疗B细胞肿瘤的临床试验目前正在进行中。然而，到目前为止，还没有研究这些治疗药物之间的分子相互作用。用SFKs抑制剂培养的肿瘤细胞的转录谱显示编码CD20抗原的MS4A1基因强烈下调。在一组原发性和确诊的B细胞肿瘤中，我们观察到SFKs抑制剂在转录水平上强烈影响CD20的表达，导致抗CD20单克隆抗体结合受到抑制，肿瘤细胞对补体依赖性细胞毒性的抵抗力增加。AKT信号通路的激活显著保护细胞免受达沙替尼触发的CD20下调。此外，SFKs抑制剂通过直接抑制自然杀伤细胞来抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在小鼠模型中也观察到利妥昔单抗的体内抗肿瘤活性减弱。值得注意的是，SFKs抑制剂对NK细胞功能的影响在很大程度上是可逆的。我们的研究结果表明，在开发新型治疗方式与抗CD20单克隆抗体的最佳组合之前，应详细评估其对靶细胞的影响。

关键词：ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；BCR，B细胞受体；CD20；CDC，补体依赖性细胞毒性；羧基荧光素琥珀酰酯；慢性淋巴细胞白血病；弥漫性大B细胞淋巴瘤；NHL，非霍奇金淋巴瘤；外周血单个核细胞；SFKs、SRC家族激酶；SRC家族激酶；达沙替尼；ofatumumab；利妥昔单抗。

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数字

图1。
图1。
用达沙替尼或PP2孵育24小时的Raji细胞的转录谱分析。(A类)使用来自对照Raji细胞或与100 nM达沙替尼或10μM PP2孵育24 h的细胞的总RNA生成cRNA，用于与人类特异性AMADID释放GE 8x60K微阵列杂交。火山图显示了用达沙替尼或PP2培养的细胞中所有安捷伦微阵列转录物的表达变化。红点代表表达发生显著变化的基因(第页<0.01，折叠变化>3，未成对t吨试验和Benjamin-Hochberg FDR<5%校正），由于达沙替尼或PP2治疗，灰色斑点代表表达没有显著变化的基因。箭头表示MS4A1型基因（蓝色斑点）。该图是使用GeneSpring（安捷伦）软件绘制的。(B类)GeneSpring（美国安捷伦）基因簇（包含MS4A1型基因），与达沙替尼或PP2孵育后，其在细胞中的表达发生类似变化。折叠变化截止值>3.0的所有基因(第页值<0.01（未配对）t吨test和Benjamin-Hochberg FDR<5%校正）被视为显著调节，并以矩阵形式呈现：每行代表一个基因，每列代表一个实验样本。在每个样本中，每个基因的转录物丰度与所有样本中基因转录物的中位数丰度的比率由基质中相应细胞的颜色表示。
图2。
图2。
有关图形图例，请参阅下一页。图2(参见上一页). SFKs抑制剂下调表面CD20水平并削弱利妥昔单抗和肿瘤单抗的抗肿瘤活性。(A类)用FITC-结合的抗CD20抗体（克隆L27，BD）在Raji细胞中测定表面CD20水平，该细胞在多SRC家族激酶抑制剂浓度增加的情况下预培养48 h。结果以对照细胞MFI的百分比表示（±SD）。(B–C类)用增加浓度的多SRC激酶抑制剂预培养48小时的Raji细胞进行清洗，并用利妥昔单抗培养1小时(B类)或属于肿瘤(C类)（1-100μg/ml）和10%人AB血清。用PI法测定CDC试验中细胞的存活率。细胞存活率表示为无抗体对照细胞的百分比（±SD）。(D类)CFSE染色的Raji细胞与利妥昔单抗或ofatumumab（100μg/ml）和NK细胞在达沙替尼或PP2存在下以6:1的E:T比率共同培养4小时。用PI染色后，用流式细胞仪测定ADCC试验中Raji细胞的存活率，并以不含利妥昔单抗/肿瘤单抗的对照细胞的百分比表示。(E类)NK和Raji细胞与利妥昔单抗（100μg/ml）和达沙替尼（100 nM）或PP2（10μM）以1:1的效靶比在37°C下同时培养4小时。对于脱颗粒试验，NK细胞与GolgiStop和抗CD107a抗体共同孵育。细胞清洗，用抗CD56、抗CD3和固定活性染料染色。为了测定细胞因子的产生，细胞被清洗，用Cytoperm/Cytofix渗透，并用抗干扰素（IFN）-γ或抗肿瘤坏死因子（TNF）抗体染色，然后进行流式细胞术分析。结果显示为CD107a、TNF或IFN-γ阳性NK细胞在整个NK细胞群中的百分比（±SD）。所示为至少3个独立实验中的一个代表。
图3。
图3。
达沙替尼在小鼠模型中削弱利妥昔单抗的抗肿瘤活性。小鼠接种5x105静脉注射EL4-hCD20细胞，并随机分为6-8组。Dasatinib每天腹腔注射一次（50 mg/kg），连续4天。在第3天和第6天静脉注射利妥昔单抗（10 mg/kg）。对照小鼠注射等量PBS。从第1天开始观察发光情况，直到第9天实验结束。数据以平均值±SEM表示，通过比较利妥昔单抗组与利妥昔单抗+达沙替尼组，得出统计显著性，第页= 0.0045,t吨测试。所示为两个独立实验中的一个代表。
图4。
图4。
达沙替尼对原发性CD20阳性白血病/淋巴瘤细胞CD20水平的影响。将原代人CD20阳性B-CLL/淋巴瘤细胞（总n=30；CLL n=25，MCL n=4，FL n=1）与浓度增加的达沙替尼一起孵育48小时。清洗后，细胞在室温黑暗中与饱和量的FITC-结合抗CD20单克隆抗体（克隆L27，BD）孵育30分钟。在流式细胞仪分析之前，细胞用PBS清洗并用PI重新悬浮在PBS中。结果以对照细胞MFI的百分比表示（±SD）。对照组和药物治疗组之间的CD20 MFI差异具有统计学意义(第页<0.0001）采用Wilcoxon符号秩检验进行测量。
图5。
图5。
达沙替尼在转录水平调节CD20水平。(A类)用Western blotting分析预先培养48小时的Raji细胞蛋白提取物中的CD20和β-肌动蛋白，并增加达沙替尼的浓度。(B类)将Raji细胞的cDNA与达沙替尼浓度增加预孵育48 h后，用FAM和DABCYL标记的相应探针对CD20和B2M产物进行qRT-PCR扩增。(C类)用达沙替尼（100nM）和/或环己酰亚胺（10nM）预孵育24小时的Raji细胞的cDNA用于CD20、RPL29和ACTB产物的qRT-PCR扩增。(D类)在放线菌素D追踪mRNA衰变分析中，使用达沙替尼（100 nM）和/或放线菌肽（10μg/ml）预培养24 h的Raji细胞cDNA对CD20、RPL29和ACTB产物进行qRT-PCR扩增。所示为至少3个独立实验中的一个代表。
图6。
图6。
达沙替尼对CD20表达的调节需要CD20启动子。(A类)稳定转导表达CD20的HeLa细胞（HeLa pLVX-CD20-IRES-PURO）在达沙替尼浓度增加的情况下培养48小时。如前所述，测定表面CD20水平。(B类)在聚丙烯酰胺凝胶中分离改良后表达CD20-Histag融合蛋白的Raji细胞的蛋白裂解物，将其预先培养48 h，并增加达沙替尼的浓度。用抗CD20抗体检测CD20和CD20-Histag蛋白。(C类)用空载体或pGL4-wild型CD20启动子或pGL4-截断的CD20启动程序转染Raji细胞，然后用达沙替尼（100 nM）进一步培养24小时，在其裂解液中测量相对荧光素酶活性。(D类)截断的方案CD20型用于报告分析的促进剂。(E类)在转染pGL4-野生型或突变（BAT-box mut）CD20启动子的Raji细胞裂解液中，用达沙替尼（100 nM）孵育24小时，测量相对荧光素酶活性。(F类)在存在或不存在特定竞争对手的情况下，将来自Raji细胞的核裂解物与生物素化BAT-box探针混合，以控制或与达沙替尼（100 nM）孵育24小时。对形成的DNA蛋白复合物进行分析，以确定蛋白质与推测的Oct-2结合位点的结合CD20型启动子。所示为至少两个独立实验中的一个代表。
图7。
图7。
SFKs抑制剂对CD20水平的影响通过激活SFKs和BCR下游信号通路得以缓解。(A类)清洗用100 nM达沙替尼预先孵育48 h的Raji细胞，然后在不使用达沙替尼时孵育指定时间。如前所述测定CD20水平。(B类)如前所述，在AKT抑制剂（MK-2206）浓度增加的情况下预先培养Raji细胞48小时，对其表面CD20水平进行分析。(C类)在与达沙替尼预孵育的Raji细胞的蛋白裂解物中用相应的抗体检测p-AKT（Ser473）、pan AKT和p-SRC（Tyr416）。(D类)在用pGL4 wt共转染的Raji细胞的蛋白裂解物中测量相对荧光素酶活性CD20型启动子和pMIG或pMIG-myrAKT，并与达沙替尼孵育48小时。(E类)在联合转染pGL4-wt的Raji细胞蛋白裂解物中测量相对荧光素酶活性CD20型启动子和空载体wt PTEN或C124S PTEN，并与达沙替尼孵育48小时。(F类)用pMIG或pMIG-myrAKT稳定转导的Raji细胞根据GFP表达进行分类。在未分类和分类细胞的蛋白裂解液中用相应抗体检测AKT、p-AKT（Thr308，Ser473）、CD20、β-actin。(G公司)用达沙替尼预孵育24小时后，分离的Raji细胞（Raji pMIG或Raji p MIG-myrAKT）蛋白裂解物中的相应抗体检测p-AKT、AKT、CD20和β-actin。(H（H）)如前所述，测定用达沙替尼预先孵育48小时的Raji pMIG或Raji p MIG-myrAKT细胞中的表面CD20水平。结果显示为GFP阳性细胞的PE MFI（±SD）。(我)使用来自与达沙替尼预孵育24小时的Raji-pMIG和Raji-pMIG mAkt细胞的cDNA进行CD20、ACTB和RPL29产物的qRT-PCR扩增。(J型)如前所述，使用Raji pMIG或Raji p MIG-myrAKT细胞进行CDC分析。所示为至少两个独立实验中的一个代表。
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