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.2014年12月3日；34(49):16180-93.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3020-14.2014。

创伤性脑损伤后glymphatic通路功能受损促进tau病理

杰弗里·伊里夫 1, 迈克尔·J·陈 2, 本杰明·阿普洛格 2, 道格拉斯·齐彭菲尔德 三, 梅丽莎·索特罗 4, 杨丽君 2, 伊滕德·辛格 2, 拉希德·迪恩 2, 梅肯·内德加德 2
附属公司

创伤性脑损伤后glymphatic通路功能受损促进tau病理

杰弗里·伊里夫等。 神经科学. .

摘要

创伤性脑损伤（TBI）是包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）在内的痴呆症早期发展的既定风险因素，创伤后大脑经常出现由tau蛋白聚集体组成的神经原纤维缠结。我们最近定义了一个脑范围的血管旁通道网络，称为“glymphatic”通路，脑脊液沿着该通路进入和穿过脑实质，促进包括淀粉样β在内的间质溶质从大脑中清除。在这里，我们在小鼠身上证明了细胞外tau是沿着这些血管旁途径从大脑中清除的。TBI后，glymphatic通路功能降低了～60%，损伤后这种损害至少持续1个月。编码星形胶质细胞水通道水通道蛋白-4的基因敲除对血管旁间质溶质清除起重要作用，加剧了TBI后的glymphatic通路功能障碍，并促进了脑创伤后神经原纤维病理学和神经变性的发展。这些发现表明，TBI后glymphatic通路功能的慢性损伤可能是导致创伤后大脑易受tau聚集和神经变性发病的关键因素。

关键词：AQP4；水通道蛋白-4；脑脊液；神经退行性变；tau病；创伤性脑损伤。

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数字

图1。
图1。
TBI导致星形细胞末端足血管周围AQP4极化丢失。A类，描述中度TBI的“击中并逃跑”模型的示意图（Ren等人，2013）。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，用门牙将其悬挂在绳子上，通过气动控制的皮质撞击器装置进行校准的暂时撞击。动物跌落到下面的垫子上，迅速从麻醉中苏醒。B–C类在TBI术后28天，创伤性病灶被致密的胶质瘢痕所包围，并被广泛的反应性星形胶质细胞增生所包围。此前已经广泛描述了TBI后3至28天AQP4表达和定位的变化（Ren等人，2013）。控制皮层内(天)，AQP4定位极化至大脑微循环周围的血管周围星形细胞末端脚（箭头所示）。插图仅描述了GFAP免疫反应。28天后，对侧皮层AQP4免疫反应(E类)看起来很正常。在同侧皮层创伤性病变周围的反应性星形胶质细胞增生区域（插图显示仅GFAP免疫反应）(F类)，血管周围AQP4极化持续丢失，因为非血管周围结构中的AQD4免疫反应性增加（箭头表示血管周围星形细胞终末足的位置。比例尺：20μm。
图2。
图2。
AQP4免疫反应在Aqp4型−/−老鼠。为了确保本研究中使用的抗AQP4一级抗体的特异性，我们对来自Aqp4型−/−小鼠伤后7d灌流。尽管在对照组中GFAP表达很容易检测到(A类)，对侧TBI(B类)和同侧TBI(C类)皮层，未检测到AQP4免疫反应。比例尺，20μm。
图3。
图3。
TBI后，血管旁CSF-ISF交换慢性受损。A类,B类TBI后1、3、7和28天，通过脑室内注射CSF示踪剂（卵清蛋白结合Alexa 555；OA-45）评估血管旁CSF–ISF交换。C–F类,体外全切片荧光成像显示，注射后30分钟评估的血管旁脑脊液内流在TBI后7天显著减少。有趣的是，尽管存在单侧创伤性损伤，双侧仍观察到glymphatic内流减少。示踪剂流入皮层的定量(G公司)表明TBI对脑脊液流入的影响在伤后7天达到峰值；然而，损伤后28天，glymphatic功能仍有明显损伤(***第页<0.001 vs对照组；###第页<0.001 vs对侧结构；Tukey's双向方差分析事后（post-hoc）多重比较测试，n个=每组5-12只动物）。虽然在双侧皮层和纹状体都观察到脑脊液内流受损，但同侧皮层的损伤最大。
图4。
图4。
间质τ沿着血管旁的glymphatic途径清除。A类将重组hTau注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双转基因小鼠的皮层中，该双转基因小鼠在血管内皮中表达GFP，在脑血管平滑肌和周细胞中表达Ds红色荧光蛋白。B–H型，注射30分钟后用免疫荧光法评估间质hTau在完整大脑中的运动。hTau从注射部位扩散移动(B类,C类)沿着皮层下白质轨道和血管周围空间移动，沿着大的引流静脉离开大脑。实质内节段的高倍显微照片(天)和大脑的出口(E类)鼻腔尾静脉显示hTau在该静脉周围的血管旁间隙积聚（箭头）。这包括位于大脑表面的大表面静脉结构的壁（箭头所示）。插图描绘X-Z轴和Y-Z轴共焦叠加的正交视图。右下角插图描绘了没有hTau荧光通道的血管报告蛋白。星号表示血管管腔。F类hTau沿附近穿透动脉的缺失表明动脉旁间隙不是间质hTau清除的长程途径。大脑远端内侧内静脉的高强度hTau标记(G公司)和下矢状窦(H（H）)表明这些静脉结构是间质hTau的主要流出途径。比例尺：20μm。我伤后7天评估TBI对皮质间质溶质清除的影响。放射性标签的清除三氢甘露醇（MW 182 Da；J)和14C-菊粉（MW～5 kDa；K（K）)在注入对侧额叶皮层60分钟后进行测量。在野生型小鼠中，TBI显著减缓了两者的清除三H-甘露醇和14C-菊粉(#第页< 0.05,###第页<0.001 TBI与假手术；Tukey's双向方差分析事后（post-hoc）多重比较测试；n个=每组6只动物）。年进行的间隙研究Aqp4型−/−小鼠证明TBI后溶质清除障碍因以下因素而加剧Aqp4型基因缺失(*第页< 0.05, ***第页<0.001野生型vsAqp4型−/−老鼠；Tukey's双向方差分析事后（post-hoc）多重比较测试，n个=每组6只动物）。
图5。
图5。
Aqp4型基因缺失不会加剧慢性创伤性病变的发展。影响Aqp4型在TBI后28天采集的大脑中评估创伤性损伤体积的基因缺失。A类,B类脑连续切片，H&E染色评价脑结构。红色箭头表示创伤性撞击的部位和皮质损伤最大的区域。测量每个切片的同侧和对侧皮层面积，然后通过连续切片进行整合，得出皮层体积。同侧皮质体积表示为与对侧体积的比值(C类). 野生型和对照组同侧病变体积无显著差异Aqp4型−/−小鼠（未配对t吨测试）。
图6。
图6。
创伤后P-tau积累因以下因素而加剧Aqp4型基因缺失。通过以下途径损害glymphatic通路功能的作用Aqp4型评估TBI后tau病发生时的基因缺失。A类、野生型和Aqp4型−/−伤后28天采集脑组织，检测P-tau表位的存在。代表性的杂交显示了小鼠基因型（野生型vsAqp4型−/−)，损伤状态（假手术与创伤性脑损伤），以及半球[对侧（C）与同侧（I）]。还测量了总τ（Pan-tau），并将每个生物样品中的所有P-tau水平归一化为P-tau。B–F类在所有表位中，TBI倾向于增加P-tau标记，尤其是在同侧半球。当靶向pThr205的抗体时，TBI对P-tau标记的影响具有统计学意义(C类)，pThr231(天)和pSer396(E类)使用了（双向方差分析，n个=每组3-4人）。后hoc分析表明Aqp4型TBI后基因缺失显著增加pThr231标记(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; Tukey's双向方差分析事后（post-hoc）多重比较测试，n个=每组3-4人）。
图7。
图7。
脑外伤后神经细胞P-tau积累与轴突变性Aqp4型−/−老鼠。野生型和Aqp4型−/−小鼠接受TBI，并在损伤后28天通过免疫荧光评估P-tau的存在。AT8 P-tau抗体（特异于pSer202/pThr205表位）和神经元标记物NeuN的双重标记表明，在对照条件下，在野生型皮层中未观察到P-tau免疫反应(A类). TBI后，P-tau免疫反应性普遍增强，但处于低水平(B类). 在Aqp4型−/−皮层(C类)TBI后，在神经元胞体（箭头）和周围神经突起（箭头）中观察到标记的P-tau标记。皮层P-tau免疫反应的定量(天)和纹状体(E类)创伤性病变附近的区域显示，P-tau在Aqp4型−/−脑外伤后的大脑。F–K型用SMI34单克隆抗体对磷酸化神经丝进行染色，评价TBI后28天同侧皮层和胼胝体下轴索变性。在控制皮层(F类)和胼胝体(我)，未见明显的轴突球状体或静脉曲张。TBI后野生型皮层(G公司)SMI34-免疫活性静脉曲张很少出现（箭头所示）。在Aqp4型−/−皮层(H（H）)和胼胝体(K（K）)SMI34阳性球体和静脉曲张很容易检测到（箭头所示）。
图8。
图8。
Aqp4型基因缺失促进TBI后的神经炎症Aqp4型评估TBI后神经炎症持续存在时的基因缺失。A–F、野生型和Aqp4型−/−小鼠接受TBI和反应性星形胶质细胞增生症（GFAP表达），并在损伤后28天通过免疫荧光法评估对侧和同侧皮层的微胶质细胞增生（Iba1表达）。与TBI后的野生型小鼠相比，同侧大脑皮层的GFAP和Iba1免疫活性显著升高Aqp4型−/−TBI后的小鼠。G公司，GFAP标记定量显示同侧大脑皮层的反应性星形胶质细胞增生显著增加Aqp4型−/−老鼠(###第页<0.001，同侧与对侧Aqp4型−/−; Tukey's双向方差分析事后（post-hoc）多重比较测试；n个=每组4只动物），这在野生型小鼠中不存在(**第页< 0.01,Aqp4型−/−同侧与WT同侧）。H（H），Iba1标记的定量结果显示，同侧大脑皮层的小胶质细胞活化同样增加Aqp4型−/−老鼠(#第页<0.05，同侧与对侧Aqp4型−/−).
图9。
图9。
Aqp4型基因缺失加剧创伤后认知功能障碍。A类，在野生型和Aqp4型−/−小鼠接受TBI。动物在受伤前2天接受基线行为测试，然后在TBI后每周进行一次。B类，通过旷场测试评估粗大运动行为。TBI没有显著改变野生型小鼠在野外试验中的表现；然而，在进行TBI后，在野外测试中的表现明显受损Aqp4型−/−老鼠(#第页< 0.05Aqp4型−/−控制vsAqp4型−/−TBI；双向重复测量方差分析；n个=每组9-14人）。C类，通过旋转试验评估运动协调性。虽然TBI并未显著影响野生型动物的旋转动物性能，但在Aqp4型−/−小鼠TBI显著影响测试性能(#第页< 0.05Aqp4型−/−控制vsAqp4型−/−TBI；Sidak的双向重复测量方差分析事后（post-hoc）多重比较测试，n个=每组9-14只动物）。认知功能通过新物体识别测试进行评估(天)巴恩斯迷宫测试(E类). 在这两项测试中，TBI损害了野生型和Aqp4型−/−老鼠[*第页< 0.05, **第页<0.01 WT控制vs WT TBI；#第页< 0.05,##第页< 0.05Aqp4型−/−控制vsAqp4型−/−TBI；Sidak的双向重复测量方差分析事后（post-hoc）多重比较测试；n个=每组9-14只动物（新物体识别），n个=每组5人（巴恩斯迷宫）]。创伤后认知功能障碍在Aqp4型−/−小鼠与野生型动物的比较(†第页<0.05重量TBI vsAqp4型−/−TBI）。
图10。
图10。
创伤后glymphatic通路功能受损促进tau聚集。血管周围AQP4极化、glymphatic pathway功能和TBI后间质tau清除之间拟议关系的示意图。我们认为TBI后血管周围AQD4极化的慢性丧失会损害血管旁间隙tau清除，促进tau聚集、神经退行性变化，以及脑外伤后持续的神经炎症。
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