Glutamine oxidation maintains the TCA cycle and cell survival during impaired mitochondrial pyruvate transport

doi:10.1016/j.molcel.2014.09.025

。2014年11月6日；56(3):414-424.

doi:10.1016/j.molcel.2014.09.025。 Epub 2014年10月21日。

谷氨酰胺氧化在线粒体丙酮酸转运受损期间维持TCA循环和细胞存活

附属公司

¹德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
²德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502；德克萨斯大学西南医学中心儿科，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
^三德克萨斯大学西南医学中心高级成像研究中心，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
⁴美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心麦克德莫特人类生长与发展中心，邮编75390-8502。
⁵美国犹他州盐湖城犹他大学医学院生物化学系，犹他州84112-5650。
⁶德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502；美国得克萨斯州达拉斯得克萨斯大学西南医学中心儿科7590-8502；麦克德莫特人类生长与发展中心，德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，德克萨斯州7590-8502，美国。电子地址：Ralph.deberardinis@utsouthwestern.edu。

PMID： 25458842
预防性维修识别码： PMC4268166型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.09.025

谷氨酰胺氧化在线粒体丙酮酸转运受损期间维持TCA循环和细胞存活

杨晨东等。分子电池。 2014。

。2014年11月6日；56(3):414-424.

doi:10.1016/j.molcel.2014.09.025。 Epub 2014年10月21日。

附属公司

¹德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
²德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502；德克萨斯大学西南医学中心儿科，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
^三德克萨斯大学西南医学中心高级成像研究中心，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502。
⁴美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心麦克德莫特人类生长与发展中心，邮编75390-8502。
⁵美国犹他州盐湖城犹他大学医学院生物化学系，犹他州84112-5650。
⁶德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所，美国德克萨斯州达拉斯75390-8502；德克萨斯大学西南医学中心儿科，达拉斯，德克萨斯州75390-8502，美国；美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心麦克德莫特人类生长与发展中心，邮编75390-8502。电子地址：Ralph.deberardinis@utsouthwestern.edu。

PMID： 25458842
预防性维修识别码： PMC4268166型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.09.025

摘要

替代的新陈代谢模式使细胞能够抵抗新陈代谢压力。抑制这些代偿途径可能会产生合成致命性。我们之前证明，葡萄糖剥夺刺激了一条途径，在该途径中，谷氨酸脱氢酶（GDH）下游的谷氨酰胺形成乙酰辅酶a。这里我们显示丙酮酸进入线粒体抑制GDH和谷氨酰胺依赖性乙酰辅酶A的形成。抑制线粒体丙酮酸载体（MPC）激活GDH并改变谷氨酰胺代谢途径，以生成草酰乙酸和乙酰辅酶A，实现持久性三羧酸（TCA）循环功能。药物阻断GDH在培养中引起了大量的细胞抑制作用，但当与MPC抑制结合时，这些作用变成了细胞毒性。与作为单一药物使用的两种抑制剂相比，同时使用MPC和GDH抑制剂显著降低了肿瘤生长。这些数据共同定义了一种诱导谷氨酰胺分解的机制，并揭示了丙酮酸供应受损期间线粒体参与的生存途径。

PubMed免责声明

数字

**图1。丙酮酸缺乏会改变谷氨酰胺代谢，产生乙酰辅酶A和柠檬酸**
（A）顶部，Anaplerosis由[U提供-¹³C] 谷氨酰胺。谷氨酰胺通过α-KG提供OAA，而乙酰-CoA主要由其他营养物质提供，尤其是葡萄糖。底部，谷氨酰胺在没有葡萄糖衍生丙酮酸的情况下转化为乙酰辅酶A。红色圆圈表示[U产生的碳-¹³C] 谷氨酰胺和灰圈未标记。还原羧基化用绿色虚线表示。缩写：MPC，线粒体丙酮酸载体；α-KG，α-酮戊二酸；OAA，草酰乙酸。（B）琥珀酸、富马酸、苹果酸和天冬氨酸的分数包含四个¹³用[U培养SFxL细胞6小时后的碳-¹³C] 存在或不存在10mM未标记的葡萄糖（Glc）的情况下的谷氨酰胺。（C）用[U培养SFxL细胞6小时后柠檬酸盐的质量同位素-¹³C] 谷氨酰胺和10 mM未标记葡萄糖；无葡萄糖；或无葡萄糖加上6 mM未标记丙酮酸（Pyr）。（D）用[U-¹³C] 谷氨酰胺和10 mM未标记葡萄糖；无葡萄糖；或没有葡萄糖加上6 mM未标记丙酮酸。数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图2。分离的线粒体将谷氨酰胺转化为柠檬酸**
（A）全细胞裂解物（细胞）的Western blot和SFxL细胞分离线粒体（线粒体）或胞浆的制备。缩写：AIF，凋亡诱导因子；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；谷氨酸脱氢酶；ACL，ATP柠檬酸裂解酶。（B）典型线粒体样品中的耗氧量。显示了添加ADP/GDP前后的利率。（C）用[U培养30分钟的线粒体产生柠檬酸的质量同位素-¹³C] 谷氨酰胺和含或不含丙酮酸。

**图3。阻断线粒体丙酮酸转运激活谷氨酰胺依赖的柠檬酸盐形成**
（A） UK5099对[U柠檬酸盐标记的剂量依赖性影响-¹³C] 葡萄糖和[U-¹³C] SFxL细胞中的谷氨酰胺。（B）柠檬酸盐标记的时间进程-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。（C） [U培养细胞中总柠檬酸和柠檬酸m+6的丰度-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。（D）在[U中培养6小时的细胞中柠檬酸的质量同位素-¹³C] 含或不含10 mM CHC或200μM UK5099的谷氨酰胺。（E） [U培养6小时后沉默ME2对柠檬酸m+6的影响-¹³C] 谷氨酰胺。柠檬酸盐等位异构体的相对丰度是通过将质谱法测量的总柠檬酸盐丰度相对于每个样品的细胞蛋白归一化，然后乘以每个等位异构体的丰度分数来确定的。（F）在[U培养6小时后，沉默MPC1或MPC2对柠檬酸盐m+6形成的影响-¹³C] 谷氨酰胺。（G）不同MPC1基因型人原代成纤维细胞在[U培养后的柠檬酸同位素-¹³C] 谷氨酰胺。数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。另请参见图S1。

**图4。阻断线粒体丙酮酸转运代谢效应的动力学分析**
（A）的总和¹³SFxL细胞超极化暴露2分钟后获得的C光谱-¹³C] 丙酮酸盐。共振为[1-¹³C] 丙酮酸（Pyr1），[1的水合物-¹³C] 丙酮酸（Pyr1-氢化物），[1-¹³C] 乳酸（Lac1），[1-¹³C] 丙氨酸（Ala1）和H[¹³C] O（运行）_三^负极（碳酸氢盐）。（B）对照细胞和UK5099处理细胞中Lac1、Ala1和碳酸氢盐出现的时间演变。（C）相对¹³Lac1、Ala1和碳酸氢盐的C核磁共振信号。每个信号在整个采集过程中求和，并表示为总数的一部分¹³C信号。（D）对照细胞和UK5099处理细胞中细胞内和分泌丙氨酸的数量。数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；***，p<0.001。另请参见图S2。

**图5。抑制线粒体丙酮酸转运增强谷氨酰胺对脂肪酸合成的贡献**
（A）从[U培养细胞中提取的棕榈酸酯的质量同位素-¹³C] 葡萄糖或[U-¹³C] 谷氨酰胺，含或不含200μM UK5099。为了简单起见，只显示了均匀标记的同位素（m+2、m+4等）。（B）由葡萄糖或谷氨酰胺衍生的产脂乙酰辅酶A的分数，含或不含200μM UK5099。数据是三种独立培养物的平均值和SD。***，p<0.001。另请参见图S3。

**图6。线粒体丙酮酸转运受阻诱导谷氨酸脱氢酶**
（A）谷氨酸转化为AKG的两种途径。蓝色和绿色符号分别是谷氨酰胺的酰胺（γ）和氨基（α）氮素。缩写：GLS，谷氨酰胺酶；ALT/AST、丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶；谷氨酸脱氢酶。（B）谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）和氨（NH）的利用和分泌₄⁺)采用SFxL细胞，含或不含200μM UK5099。（C）分泌¹⁵N-丙氨酸和¹⁵全日空航空公司₄⁺从[α-¹⁵N] 表达对照shRNA（shCtrl）的SFxL细胞中的谷氨酰胺或两种直接对抗shRNA的其中一种*总账1*（shGLUD1-A和shGLUD1-B）。（D）左侧200μM UK5099处理期间AMPK（S172）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC，S79）的磷酸化。赖特，添加车辆或200μM UK5099后24小时ATP的稳态水平。（E）培养在[U-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。另请参见图S4。

**图7。GDH在抑制线粒体丙酮酸转运期间维持生长和活力**
（A）用50μM UK5099处理shCtrl、shGLUD1-A和shGLUD1-B SFxL细胞3天后的相对生长抑制。（B）用50μM GDH抑制剂EGCG、10μM GLS抑制剂BPTES和200μM UK5099组合处理SFxL细胞的相对生长抑制3天。（C）通过台盼蓝染色评估B组处理的SFxL细胞的相对细胞死亡。（E）左侧，经溶媒（生理盐水）、EGCG、CHC或EGCG加CHC处理的A549衍生皮下异种移植物的生长（每组4个）。数据为平均值和SEM。赖特，实验结束时采集的每个肿瘤提取物中的乳酸丰度。（A）–（D）中的数据是三种独立文化的平均值和SD。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。另请参见图S5。

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