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.2015年2月；62(2):388-97.
doi:10.1016/j.jhep.2014.09.033。 Epub 2014年10月20日。

酒精直接刺激肝星状细胞的表观遗传修饰

Agata页面 1, P Paoli桥墩 1, 斯蒂芬·希尔 1, 雷切尔·霍沃思 1, 吴绍纲 2, 宋美奎恩 2, 杰里米·弗伦奇 1, 史蒂夫·怀特 1, 津本英和 2, 德里克·阿曼 1, 杰勒娜·曼 三
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酒精直接刺激肝星状细胞的表观遗传修饰

Agata页面等人。 肝脏病学杂志. 2015年2月.

摘要

背景和目标：酒精是肝病的主要病因，也是其他肝病病因的重要共同发病因素。进展性肝病的一个共同特征是纤维化，这是由纤维形成细胞外基质（ECM）的净沉积引起的。肝星状细胞（HSC）被广泛认为是纤维化ECM的主要细胞来源。我们确定HSC是否对酒精的直接刺激有反应。

方法：将接受转分化的HSC与乙醇孵育，并测量成纤维基因和表观遗传调控因子的表达。使用ChIP-Seq和生物信息学分析研究记录变化的机制。使用从小鼠酒精模型和ALD患者肝脏分离的HSC，并通过精确切割的肝脏切片，确认乙醇诱导的变化。

结果：HSC对乙醇暴露的反应是增加促纤维化和ECM基因表达，包括弹性蛋白。乙醇诱导多种表观遗传调节因子的表达发生改变，表明在HSC转分化过程中可能调节染色质结构。MLL1是一种组蛋白3赖氨酸4（H3K4）甲基转移酶，由乙醇诱导，并招募到弹性蛋白基因启动子中，在那里它与活性染色质标记H3K4me3的富集相关。染色质免疫沉淀测序（ChIPseq）显示，乙醇对HSC表观基因组有广泛影响，并鉴定出41个基因位点，其中MML1及其H3K4me3标记均因乙醇而富集。

结论：乙醇通过刺激染色质结构的整体变化直接影响HSC的转分化，导致ECM蛋白的表达增加。酒精在HSC转分化过程中重塑表观基因组的能力为其作为肝病共同发病因素提供了机制。

关键词：ALD；弹性蛋白；表观遗传学；H3K4me3；HSC；MLL1。

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利益冲突声明

利益冲突：作者报告没有利益冲突

数字

图1
图1。乙醇加速HSC转分化并诱导ECM、纤维前生成基因和表观遗传调控因子的表达
（A） HSC激活时间过程中乙醇处理的示意图。从细胞培养诱导激活的第1天、第2天或第10天开始，用86mM乙醇处理新鲜分离的大鼠HSC 48小时。通过RT-PCR对在第1天和第2天用86mM乙醇处理24小时或48小时的至少四种不同的原代大鼠HSC制剂中胶原蛋白I、III、IV（B）、弹性蛋白、MeCP2和TIMP-1（C）组蛋白赖氨酸甲基转移酶（D，E）和组蛋白赖胺酸脱甲基酶（F，G）的（B-G）mRNA水平进行量化。误差条表示平均值±平均标准误差（SEM）。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001。（H，I）通过SDS-PAGE分离来自至少2种用86mM乙醇培养48h的大鼠HSC制剂的30μg全细胞蛋白提取物，并对MLL1（H）或弹性蛋白（I）进行免疫印迹。β-actin作为负荷对照。
图1
图1。乙醇加速HSC转分化并诱导ECM、纤维前生成基因和表观遗传调控因子的表达
（A） HSC激活时间过程中乙醇处理的示意图。从细胞培养诱导激活的第1天、第2天或第10天开始，用86mM乙醇处理新鲜分离的大鼠HSC 48小时。通过RT-PCR对在第1天和第2天用86mM乙醇处理24小时或48小时的至少四种不同的原代大鼠HSC制剂中胶原蛋白I、III、IV（B）、弹性蛋白、MeCP2和TIMP-1（C）组蛋白赖氨酸甲基转移酶（D，E）和组蛋白赖胺酸脱甲基酶（F，G）的（B-G）mRNA水平进行量化。误差条表示平均值±平均标准误差（SEM）。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001。（H，I）通过SDS-PAGE分离来自至少2种用86mM乙醇培养48h的大鼠HSC制剂的30μg全细胞蛋白提取物，并对MLL1（H）或弹性蛋白（I）进行免疫印迹。β-肌动蛋白作为负载对照。
图2
图2。乙醇诱导MLL1与弹性蛋白启动子结合，增加H3K4的三甲基化以及弹性蛋白转录和蛋白表达
（A） 50μg来自静止大鼠HSC或完全激活的肌成纤维细胞的交联染色质与5μg抗MLL1抗体孵育，并进行ChIP分析。用86mM乙醇处理第2天HSC 48小时后的交联染色质对MLL1（B）或H3K4me2和H3K4me3（C）进行（B-C）ChIP分析，如（A）所示。在ChIP之后，使用免疫沉淀的基因组DNA作为模板，使用针对弹性蛋白基因（A-C）不同区域的特异性引物进行qPCR反应。（D） 用qPCR定量三种不同PCLS制剂中的弹性蛋白mRNA水平，并用86mM乙醇处理24h、48h或72h。（E）如（E）所示，从切片中提取30μg全细胞蛋白，对弹性蛋白和β-肌动蛋白进行免疫印迹。（F） 用qPCR定量分析三种不同制备的精密切割正常大鼠肝组织切片中的弹性蛋白mRNA水平，分别用1mM醋酸钠处理24h、48h和72h。相关面板中的误差条表示平均值±平均值的标准误差（SEM）。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001。
图3
图3。ALD与MLL1和弹性蛋白表达增加相关
（A） 用qPCR法对六种不同制备的正常人肝脏或酒精性肝病外植体细胞外成分胶原蛋白I、III、弹性蛋白和纤维连接蛋白的mRNA水平进行定量。（B） 组蛋白赖氨酸甲基转移酶通过qPCR定量，如（A）所示。相关面板中的误差条代表平均值±平均标准误差（SEM）。*p<0.05；**p<0.005。（C-D）对6例正常人肝脏（NHL）或5例酒精性肝病移植组织样本的30μg全细胞蛋白进行MLL1、弹性蛋白和β-肌动蛋白免疫印迹。（E） 正常人肝脏或ALD移植肝脏中显示MLL1和弹性蛋白免疫化学染色的代表性切片。
图4
图4。ChIP-Seq揭示了乙醇处理的早期转化HSC中MLL1和H3K4三甲基化的复杂性
使用来自对照组（A）的交联染色质或用86mM乙醇（B）处理48小时的第2天HSC进行MLL1或H3K4me3的（A-B）ChIP分析，并在Illumina测序器MiSeq上对gDNA进行测序。显示MLL1和H3K4me3与大鼠HSC基因组内序列结合的相关分析图，红色簇表示序列高度相似的区域。MLL1和H3K4me3与对照组（A）和乙醇处理的HSC（B）大鼠基因组序列结合的相关性分析。红色圆圈（左上）表示乙醇暴露后MLL1仅富集的区域，浅蓝色圆圈（右下）表示结合与对照HSC中的结合没有变化的区域；绿色圆圈（右上）突出显示了MLL1和H3K4me3结合随着乙醇处理而增加的区域，紫色圆圈（右下）显示了仅H3K4me3结合在乙醇暴露后增加的区域。（C） 在用86mM乙醇培养48小时的第2天，用qPCR对四种不同的对照或大鼠HSC制剂中C-Jun的mRNA水平进行定量（左面板）。用SDS-PAGE从相同样品中分离30μg全细胞蛋白，并对c-Jun和β-actin进行免疫印迹。（D） 使用来自对照组或第2天用86mM乙醇处理48小时的HSC的交联染色质对MLL1和H3K4me3进行ChIP分析验证，并测试其与c-Jun启动子的结合。误差条表示平均值±平均标准误差（SEM）。*p<0.05；**p<0.005。E） 与A-B中一样，对从WD+乙醇喂养或对照中分离的HSC的染色质进行ChIP测定第1a1-GFP列老鼠。饼图显示了MLL1、H3K4me3和双阳性ChIP-seq组中发现的基因的数量和百分比功能聚类。
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