Interaction between neuronal nitric oxide synthase signaling and temperature influences sarcoplasmic reticulum calcium leak: role of nitroso-redox balance

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.305172

.2015年1月2日；116(1):46-55.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116305172。 Epub 2014年10月17日。

神经元一氧化氮合酶信号传导和温度之间的相互作用影响肌浆网钙渗漏：亚硝基氧化还原平衡的作用

劳尔·A·杜尔塞¹, 维拉·梅奥¹, 埃里卡·B·兰格尔¹, 韦恩·巴尔干¹, 约书亚·M·黑尔²

附属公司

¹来自佛罗里达州迈阿密大学米勒医学院跨学科干细胞研究所。
²来自佛罗里达州迈阿密大学米勒医学院跨学科干细胞研究所。JHare@med.miami.edu。

PMID： 25326127
预防性维修识别码：项目经理4282621
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.116305172号

神经元一氧化氮合酶信号转导与温度的相互作用影响肌浆网钙渗漏：亚硝基-还原平衡的作用

劳尔·A·杜尔塞等。循环研究. 2015.

.2015年1月2日；116(1):46-55.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116305172。 Epub 2014年10月17日。

作者

劳尔·A·杜尔塞¹, 维拉·梅奥¹, 艾瑞卡·B·兰格尔¹, 韦恩·巴尔干¹, 约书亚·M·黑尔²

附属公司

¹来自佛罗里达州迈阿密大学米勒医学院跨学科干细胞研究所。
²来自佛罗里达州迈阿密大学米勒医学院跨学科干细胞研究所。JHare@med.miami.edu。

PMID： 25326127
预防性维修识别码：项目经理4282621
内政部： 101161年10月11日/基雷沙.116.305172

摘要

理论基础：虽然一氧化氮（NO）信号调节心脏功能和兴奋-收缩耦合，但由于实验条件不一致，尤其是温度方面，相反的结果混淆了阐明NO信号通路的能力。这里，我们表明温度显著调节NO效应。

目标：为了验证温度深刻影响亚硝基-还原平衡从而影响肌浆网（SR）钙（Ca（2+））泄漏的假说。

方法和结果：我们测量了野生型（WT）、NO/氧化还原失衡（神经元型一氧化氮合酶缺陷小鼠-1[NOS1（-/-）]和超S-亚硝基谷胱甘肽还原酶缺陷（GSNOR（-/-]）小鼠心肌细胞中SR-Ca（2+）的泄漏。在WT心肌细胞中，SR-Ca（2+）泄漏增加是因为温度从37°C降至23°C，而在NOS1（-/-）细胞中，当温度超过30°C时，泄漏突然增加。GSNOR（-/-）心肌细胞在整个温度范围内表现出低泄漏。外源性NO对NOS1（-/-）心肌细胞具有双向作用；在37°C时减少泄漏，但在亚生理温度下增加泄漏。氧嘌呤醇和Tempol减少了NOS1（-/-）心肌细胞的泄漏。从37°C冷却到23°C增加了WT中活性氧的生成，但降低了NOS1（-/-）心肌细胞中的活性氧生成。氧嘌呤醇进一步减少了活性氧的生成。在23°C的WT细胞中，四氢生物蝶呤（一种必需的NOS辅因子）可减少渗漏。冷却显著增加NOS1（-/-）细胞中SR-Ca（2+）含量，但对WT或GSNOR（-/--）无影响。

结论：钙（2+）泄漏与温度通常成反比，而NOS1缺乏则会逆转这种效应，因为温度升高，导致泄漏增加，活性氧生成增加。减少脱氮（GSNOR缺乏）消除了泄漏对温度的依赖性。因此，温度调节NO和活性氧物种之间的平衡，而活性氧物种又对SR Ca（2+）产生主要影响。

关键词：5,6,7,8-四氢生物蝶呤；钙信号；诱导性低温；一氧化氮；一氧化氮合酶；亚硝基-还原失衡；活性氧物种。

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数字

**图1。SR钙²⁺泄漏对温度敏感**
（A） SR-Ca的依赖性²⁺WT和NOS1中的槽温度泄漏^−/−匹配SR-Ca时心肌细胞的平均值²⁺负荷≈75μmol/L。（B）SR-Ca²⁺WT和NOS1在23°C或37°C时的负荷泄漏关系^−/−心肌细胞**对与37°C下的WT相比，<0.01***对<0.001 vs.34°C下的WT（双向方差分析）†对<0.05 NOS1^{−/ −}37°C vs.23°C；††对37°C与23°C时<0.01 WT（指数增长拟合）。

**图2。心肌细胞中的活性氧物种与渗漏有关**
（A） SR钙²⁺WT和NOS1泄漏^{−/ −}23°C或37°C[匹配SR Ca²⁺负荷≈75μmol/L]（学生t检验）。（B） WT和NOS1中的ROS^{−/ −}在23°C或37°C下（学生t检验），通过H的表观荧光测定₂初始读数后5分钟DCF。（C） SR-Ca的依赖性²⁺WT或NOS1温度泄漏^−/−心肌细胞在没有或存在1mmol/L Tempol[在匹配的SR-Ca下²⁺负载≈75μmol/L](*对<0.05和**对<0.01（−治疗的WT；.††（-）Tempol vs.+Tempol对<0.0001（-）Tempol vs.+Tempol处理的NOS1^−/−心肌细胞；双向方差分析）。（D） SR钙²⁺WT或NOS1中的负荷泄漏关系^−/−心肌细胞，未处理和Tempol在23°C下处理(**对<0.01 WT（-）Tempol与WT+Tempol和††对<0.01 NOS1^−/−（-）Tempol与NOS1^−/−+坦普尔）。（E） 37°C时(***对<0.0001 WT（-）Tempol vs.WT+Tempol和††对<0.001 NOS1^−/−（-）Tempol与NOS1^−/−+Tempol；指数增长拟合。

**图3。黄嘌呤氧化酶衍生超氧化物介导心肌细胞渗漏增加**
（A） H的代表性图像₂DCF荧光对WT或NOS1中ROS的反应^−/−23°C或37°C条件下存在或不存在100μmol/L氧嘌呤醇的心肌细胞(酒吧，10μm）。（B） WT或NOS1中的ROS平均产量^−/−在23°C或37°C条件下，心肌细胞在存在或不存在氧嘌呤醇100μmol/L的情况下。通过H存在时每个菌株的最大信号对值进行标准化₂O（运行）₂（过氧化氢酶处理的心肌细胞作为阴性对照）*对<0.05, **对<0.01和***对<0.001（-）氧与+氧处理的心肌细胞，Student t检验。（C） SR-Ca的依赖性²⁺NOS1温度泄漏^−/−在没有或存在100μmol/L氧嘌呤醇的心肌细胞[在匹配的SR-Ca²⁺负载≈75μmol/L](**对<0.01（-）氧与+氧处理NOS1^−/−，双向方差分析）。（D） SR钙²⁺未处理和氧化嘌呤醇处理NOS1的负荷-泄漏关系^−/−心肌细胞在23°C和（E）37°C时（†对<0.05（-）氧vs.+Oxy NOS1^−/−; 指数增长拟合）。

**图4。缺乏NOS1衍生的NO是非典型SR Ca的基础²⁺NOS1中的泄漏温度模式^−/−心肌细胞**
（A） SR-Ca的依赖性²⁺NOS1温度泄漏^−/−在没有或存在1μmol/L SNAP的心肌细胞[在匹配的SR-Ca²⁺负载≈75μmol/L](*对<0.05（-）SNAP与+SNAP治疗的NOS1^−/−，双向方差分析）。（B） SR-Ca的依赖性²⁺在没有或存在100μmol/L L-VNIO的情况下[在匹配的SR-Ca下]WT心肌细胞随温度发生泄漏²⁺负载≈75μmol/L](*对<0.05（-）L-VNIO与+L-VNIO-创建WT，双向方差分析）。

**图5。ROS和温度相关SR-Ca²⁺GSNOR中的泄漏减弱^−/−心肌细胞**
（A） H的代表性图像₂DCF荧光对WT和GSNOR中ROS的响应^−/−心肌细胞在23°C或37°C下（Bar，10μm）。（B） WT和GSNOR的ROS平均产量^−/−心肌细胞温度为23°C或37°C。通过H存在时每个菌株的最大信号对值进行标准化₂O（运行）₂(*对<0.05 vs.WT，学生t检验）。（C） SR-Ca的依赖性²⁺WT控制心肌细胞或GSNOR随温度泄漏^−/−在没有或存在100μmol/L H的情况下₂O（运行）₂，[在匹配的SR-Ca下²⁺负载≈75μmol/L](*对<0.05重量vs.GSNOR^−/−，双向方差分析）。

**图6。SR钙²⁺内容由NOS1中的泄漏控制^−/−心肌细胞**
（A） SR钙²⁺WT中的负荷与NOS1相比^−/−或GSNOR^−/−23°C和37°C之间不同温度下的心肌细胞(*对<0.05和**对<0.01; 学生t检验）；（B） SR-Ca之间的线性回归²⁺泄漏与平均SR-Ca²⁺WT（黑色）或NOS1中的负载^−/−（红色）和GSNOR^−/−（青色）心肌细胞。

**图7。一氧化氮合酶解偶联增加WT心肌细胞低温渗漏**
（A）通过检测23°C、25°C、30°C、34°C或37°C下DAF-2荧光测定WT心肌细胞中的NO生成。荧光表示为相对荧光单位（F/F₀)通过将每个温度（F）下的DAF-2信号归一化为23°C（F）时的荧光₀)（N=4只小鼠*对<0.05 vs.23°C，单向方差分析）。（B） SR-Ca之间的线性相关性²⁺在所有研究温度下WT心肌细胞的泄漏和NO生成。（C） SR钙²⁺泄漏[在匹配的SR-Ca处²⁺在缺乏（BL）或存在100μmol/L四氢生物蝶呤（BH）的情况下，WT心肌细胞的负荷≈75μmol/L]₄)2或20分钟(*对<0.05，学生t检验）。（D）暴露于23°C、30°C和37°C 30分钟后，WT心肌细胞中NOS1、NOS2和NOS3的mRNA含量。（N=4；学生t检验）。

**图8。温度对舒张性RyR2介导Ca影响的拟议工作模型²⁺泄漏**
A）在生理温度条件下，NOS1活性正常，其与XOR的相互作用通过调节比例的S-亚硝基半胱氨酸使RyR2保持稳定状态。B）在亚生理温度下，NOS1活性降低，从而增加超氧化物（O₂⁻)XOR生产，导致BH₄氧化，NOS1与进一步的ROS生成解耦联，从而促进过亚硝酸根（ONOO）的生成⁻)以及RyR2上硫醇分子的氧化。在这些条件下，RyR2变得更容易受到Ca的影响²⁺泄漏。

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1. Gonzalez DR、AT MS、Sun QA、Stamler JS、Hare JM。心脏离子通道的S-亚硝基化。心血管药理学杂志。2009-项目管理咨询公司-公共医学
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