Neuronal and astrocyte dysfunction diverges from embryonic fibroblasts in the Ndufs4fky/fky mouse

doi:10.1042/BSR20140151

.2014年11月21日；34（6）：e00151。

doi:10.1042/BSR20140151。

Ndufs4fky/fky小鼠的神经和星形胶质细胞功能障碍与胚胎成纤维细胞不同

马修·J·伯德¹, 小南·W·维杰耶拉通², 贾斯珀·C·科门¹, 阿德里安·拉斯科夫斯基¹, 迈克尔·T·瑞恩², 大卫·R·托本¹, 安·弗雷泽¹

附属公司

¹*澳大利亚维多利亚州3052帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所。
²澳大利亚维多利亚州邦多拉拉筹伯大学拉筹伯分子科学研究所生物化学系，邮编3086。

PMID： 25312000
PMCID公司：项目经理4240023
内政部： 10.1042/BSR20140151

Ndufs4fky/fky小鼠的神经和星形胶质细胞功能障碍与胚胎成纤维细胞不同

马修·J·伯德等。 Biosci代表. 2014.

.2014年11月21日；34（6）：e00151。

doi:10.1042/BSR20140151。

作者

马修·伯德¹, 小南·W·维杰耶拉通², 贾斯珀·C·科门¹, 阿德里安·拉斯科夫斯基¹, 迈克尔·T·瑞恩², 大卫·R·托本¹, 安·弗雷泽¹

附属公司

¹*澳大利亚维多利亚州3052帕克维尔皇家儿童医院默多克儿童研究所。
²澳大利亚维多利亚州邦多拉拉筹伯大学拉筹伯分子科学研究所生物化学系，邮编3086。

PMID： 25312000
PMCID公司：项目经理4240023
内政部： 10.1042/BSR20140151

摘要

线粒体功能障碍会导致一系列早期神经疾病，并导致神经退行性疾病。然而，神经损伤的机制尚不清楚，因为很难从患者身上获取相关组织，而且合适的模型也有限。因此，我们评估了CI（复合物I）缺陷Ndufs4 KO（敲除）小鼠（Ndufs4fky/fky）线粒体疾病LS（Leigh综合征）和MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）的神经相关原代细胞系的线粒体功能。尽管所有Ndufs4fky/fky细胞类型的CI结构和功能都受到损害，但MEF中线粒体膜电位选择性受损，与CI依赖性ATP合成减少相关。此外，仅在Ndufs4fky/fky初级MEF中观察到活性氧生成增加和细胞死亡敏感性改变。相反，Ndufs4fky/fky初级等皮质神经元和初级等皮质星形胶质细胞仅表现出ATP生成受损，而线粒体膜电位没有变化。因此，Ndufs4fky/fky小鼠的神经功能障碍可能部分源于神经元和星形胶质细胞中更严重的ATP耗竭，即使以维持线粒体膜电位为代价。这可能会保护细胞免受死亡，但最终会损害神经元和星形胶质细胞的细胞功能。此外，从复合体II到CI的RET（逆向电子转移）在神经元中比MEF或星形胶质细胞中更为显著，在Ndufs4fky/fky细胞中减弱。

PubMed免责声明

数字

**图1。中的CI活动*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系**
从+/+（白条）和*恩杜夫斯4^飞/飞*使用CI亚基NDUFS4和CII亚基SDHA抗体作为负荷对照，通过Western blot分析在葡萄糖或半乳糖培养基（原代MEF、原代星形胶质细胞）或NBM（原代神经元）中生长的（灰条）小鼠(A类). 为了清晰起见，图像已经进行了数字裁剪。CI活动相对于CS活动(B类)和CS活动(C类)在来自+/+和*恩杜夫斯4^飞/飞*通过分光光度法在葡萄糖培养基（原代MEF，原代星形胶质细胞）或NBM（原代神经元）上培养小鼠。误差线=S.E.M。，n个≥7,*P（P）*由双尾未配对生成的值t吨测验。CI，复合物I；CII，复合体II；CS，柠檬酸合成酶。

**图2。呼吸道复合物的BN-PAGE分析*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系**
源自+/+和*恩杜夫斯4^飞/飞*将维持在葡萄糖或半乳糖培养基（原代MEFs、原代星形胶质细胞）或NBM（原代神经元）上的小鼠溶解在含有1%Triton X-100（A和C）或1%洋地黄苷的缓冲液中(B类,D类)和由BN-PAGE分离的蛋白质复合物。将凝胶转移到膜上，并用针对CI亚单位NDUFA9的抗体进行免疫修饰(A类,B类)或针对CIII亚单位Core1(C类,D类). CII亚单位SDHA用作负荷控制。n个=1–3.为了清晰起见，图像已进行了数字裁剪。CI–IV，复合物I–IV；Ci，在无NDUFS4的情况下形成的残缺Ci。

**图3。ΔΨ的分析_米在里面*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系**
ΔΨ_米通过线粒体中TMRM的积累进行测量，并与原始MEF和+/+（白色条）星形胶质细胞中的细胞数量相关*恩杜夫斯4^飞/飞*（灰条）小鼠，用葡萄糖维持(A类,C类)或半乳糖(B类,D类)中等。ΔΨ_米如图所示，用CI抑制剂鱼藤酮或原粒FCCP降低，或用CV抑制剂寡霉素调节。ΔΨ_米通过显微镜对初级神经元进行评估(电子)通过测量阳离子染料TMRM在富含线粒体的核周区的积累，用鱼藤酮进行预培养和后培养。使用≥2个细胞培养物分析每个培养皿中超过60个细胞。显示了中初级神经元的代表性图像(F类)与FCCP孵育前和孵育后。误差线=S.E.M。，n个≥3 (A类–D类),*P（P）*由双尾未配对生成的值t吨测验。CI和CV，配合物I和V；ΔΨ_米线粒体膜电位。

**图4。ATP合成速率*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系，相对于用琥珀酸+鱼藤酮（S+R）测定的CII依赖率表达**
在渗透性细胞或从MEF分离的线粒体和葡萄糖维持的星形胶质细胞中测量ATP合成的CII-（S）和CI-依赖性（G+M，P+M）速率(A类,B类,电子,F类)或半乳糖(C类,D类)和神经元维持在NBM培养基上(**G公司**)来自+/+（白色条）和*恩杜夫斯4^飞/飞*（灰色条）老鼠。如有说明，添加鱼藤酮以抑制CI。错误条=S.E.M.复制：S(n个≥3); G+M公司(n个≥3); G+M+R(n个≥2); P+M公司(n个≥3); 和P+M+R(n个≥2).P（P）由双尾未配对生成的值t吨测验。CI，复合物I；G、谷氨酸；M、苹果酸；P、丙酮酸；R、鱼藤酮；S、琥珀酸盐。

**图5。O（运行）₂^•−和H₂O（运行）₂生产*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系**
O的速率₂^•−生成量通过DHE的细胞积累进行测量，并与原始MEF和来自+/+（白条）和*恩杜夫斯4^飞/飞*（灰条）小鼠，用葡萄糖维持(A类,D类)，或半乳糖(B类,电子)中等。O的速率₂^•−如图所示，用CI抑制剂鱼藤酮调节产量。O的比率₂^•−从鱼藤酮处理细胞到非处理细胞（+鱼藤酮/-鱼藤酮）的产量在(C类)和(F类). H的比率₂O（运行）₂用Amplex Red测量葡萄糖生长的初级MEF的分离线粒体和+/+和*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠(**G公司**,**H（H）**)结果显示为琥珀酸盐+鱼藤酮（左年-轴）或谷氨酸+苹果酸（右侧年-轴）。为了保持统计能力，只对基因型进行了比较，但对琥珀酸盐与鱼藤酮的组间比较除外，因为这种差异特别有趣(**G公司**,**H（H）**). 误差线=S.E.M。，n个≥3,*P（P）*由双尾未配对生成的值t吨测验。

**图6。细胞死亡*恩杜夫斯4^飞/飞*细胞系**
来自+/+和*恩杜夫斯4^飞/飞*流式细胞术检测小鼠进入细胞死亡状态。原发性MEF的死亡细胞与+/+（葡萄糖培养基上）的比率如下所示(A类)和星形胶质细胞(B类)在葡萄糖培养基上培养1天或半乳糖培养基上培育1天或4天，有或没有急性H₂O（运行）₂分析前治疗6h。可行的单细胞初级MEF的百分比如下所示(C类,电子)和星形胶质细胞(D类,F类)在葡萄糖或半乳糖中培养1天或4天(电子,F类)或不带(C类,D类)急性H₂O（运行）₂分析前治疗6h。误差线=S.E.M。，n个≥4,*P（P）*由双尾未配对生成的值t吨测试使用Holm–Sidak方法（GraphPad，PRISM V6.0b）校正多重比较*=*P（P）*≤0.050, **=*P（P）*≤0.005. PI，碘化丙啶。

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1. Munnich A.、Rustin P.线粒体疾病的临床谱和诊断。美国医学遗传学杂志。2001;106:4–17. doi:10.1002/ajmg.1391。-内政部-公共医学
1. Pfeffer G.，Chinnery P.F.线粒体肌病的诊断和治疗。医学年鉴2013；45:4–16. doi:10.3109/07853890.2011.605389。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Koopman W.J.H.、Distelmaier F.、Smeitink J.A.M.、Willems P.H.G.M.OXPHOS突变和神经变性。EMBO J.2013；32:9–29. doi:10.1038/emboj.2012.300。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. DiMauro S.，Schon E.A.神经系统中的线粒体疾病。每年。神经科学版。2008;31:91–123. doi:10.1146/annurev.neuro.30.051606.094302。-内政部-公共医学

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[10] DiMauro S.，Schon E.A.神经系统中的线粒体疾病。每年。神经科学版。2008;31:91–123. doi:10.1146/annurev.neuro.30.051606.094302。-内政部-公共医学

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