Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes

doi:10.1016/j.jprot.2014.09.011

.2015年4月6日：118:81-94。

doi:10.1016/j.jprot.2014.09.011。 Epub 2014年10月2日。

邻近生物素化和亲和纯化是染色质相关蛋白复合物相互作用组定位的补充方法

珍妮·菲利佩·兰伯特¹, 莫妮卡·图科尔斯卡¹, 克里斯托弗·郭², 詹姆斯·D·R·奈特¹, 安妮·克劳德银杏^三

附属公司

¹加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunefeld-Tanenbaum研究所，M5G 1X5。
²加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunenfeld Tanenbaum研究所M5G 1X5；加拿大多伦多M5S 1A8多伦多大学分子遗传学系。
^三加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所，M5G 1X5；加拿大多伦多M5S 1A8多伦多大学分子遗传学系。电子地址：gingras@lunenfeld.ca。

PMID： 25281560
预防性维修识别码：项目经理4383713
内政部： 2016年10月10日/j.jprot.2014.09.011

邻近生物素化和亲和纯化是染色质相关蛋白复合物相互作用组定位的补充方法

让-菲利普·兰伯特等。蛋白质组学杂志. 2015.

.2015年4月6日：118:81-94。

doi:10.1016/j.jprot.2014.09.011。 Epub 2014年10月2日。

作者

珍妮·菲利佩·兰伯特¹, 莫妮卡·图科尔斯卡¹, 克里斯托弗·郭², 詹姆斯·D·R·奈特¹, 安妮·克劳德银杏^三

附属公司

¹加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunefeld-Tanenbaum研究所，M5G 1X5。
²加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所，M5G 1X5；加拿大多伦多M5S 1A8多伦多大学分子遗传学系。
^三加拿大多伦多大学大道600号西奈山医院Lunenfeld Tanenbaum研究所M5G 1X5；加拿大多伦多M5S 1A8多伦多大学分子遗传学系。电子地址：gingras@lunenfeld.ca。

PMID： 25281560
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摘要

绘制染色质相关蛋白的蛋白-蛋白相互作用仍然具有挑战性。在这里，我们探索了BioID的使用，这是一种近距离生物素化方法，将突变的生物素连接酶（BirA*）融合到感兴趣的诱饵上，允许生物素的局部激活以及诱饵附近蛋白质的生物素化。BioID可以成功绘制核心组蛋白和介体复合体成员的相互作用组图谱。我们研究了BioID方法产生的背景信号，发现使用不同类型的控件增加了SAINTexpress统计分析的严格性。BioID与我们针对染色质相关蛋白复合物优化的AP-MS协议的直接比较表明，这些方法识别出的共享相互作用伙伴很少，并且丰富了不同的生物过程；然而，这两种方法都允许恢复有生物学意义的相互作用。虽然两种技术对具有特定功能的蛋白质复合物都没有明显的偏见，但BioID允许纯化细胞丰度较低的蛋白质。最后，我们能够通过BioID识别MED4与中心体的强烈关联，并通过免疫荧光验证了这一发现。总之，BioID补充了AP-MS对染色质相关蛋白复合物的研究。

生物学意义：这份手稿描述了BioID的应用，这是一种接近生物素化方法，用于染色质相关蛋白，即核心组蛋白和介体复合体的成员。我们观察到，BioID成功地识别了被测毒饵的已知交互伙伴，但也允许识别新的假定交互伙伴。通过对BioID与相互作用组映射标准方法（亲和纯化-质谱联用，AP-MS）进行详细比较，我们表明这些方法是互补的，可以纯化不同的相互作用伙伴。这些相互作用的伙伴在与其相关的生物过程中不同，但在其丰度上也不同。BioID代表着染色质研究领域的一项重大技术发展，它将相互作用组映射的搜索空间扩展到AP-MS所能实现的范围之外。本文是题为《健康与疾病中的蛋白质动力学》的特刊的一部分。客座编辑：Pierre Thibault和Anne-Claude Gingras。

关键词：亲和纯化与质谱联用；生物ID；染色质；蛋白质-蛋白质相互作用；邻近生物素化；系统生物学。

PubMed免责声明

数字

图1
交互组映射的BioID和AP-MS方法概述。有关详细信息，请参阅文本和方法。

图2
BioID背景受外源BirA*表达和定位的影响。（A） T-REx-Flp在HEK293细胞系中，稳定表达GFP BirA*-FLAG、NLS BirA*-FLAG或在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上生长的无构建体（空）。用甲醛固定细胞，并对生物素化蛋白、FLAG标记蛋白（诱饵）和DAPI（细胞核）进行染色。（B）维恩图显示了由BioID从稳定表达GFP-BirA*-FLAG、NLS-BirA*-FLAG或无结构体（空）的HEK293细胞中的T-REx Flp-In鉴定的蛋白质重叠。（C） BioID分析中从稳定表达GFP-BirA*-FLAG或NLS-BirA*-FLAG的HEK293细胞中的T-REx Flp-in鉴定的蛋白质的三个重复的光谱计数总和。对角线映射到GFP-BirA*-FLAG和NLS-BirA*-FLAG样本的相等光谱计数。

图3
BioID成功定位组蛋白H2B和H3的相互作用体。（A）在使用不同类型的背景控制和压缩参数运行SAINTexpress后，通过组蛋白H2B和H3的BioID分析检测到的重要相互作用伙伴的维恩图。（B）组蛋白H2B和H3的BioID和AP-MS（[3]中产生的数据）分析检测到的重要相互作用伙伴的维恩图。（C） H2B和H3重要交互伙伴的功能注释；绘制了生物过程的蛋白质计数（GO FAT），Benjamini-Hochberg FDR校正值为0.01或更小。补充图2显示了导致GO术语GO:0051276（*，染色质组织）和GO:0006974（**，对DNA损伤刺激的反应）的蛋白质。

图4
BioID和AP-MS显示组蛋白H2B和H3的相互作用伙伴的不同轮廓。（A）由BioID和AP-MS识别的选定交互伙伴的点图。节点颜色表示绝对光谱计数总和（此处上限为50，以便于显示），节点边缘颜色对应于SAINTexpress FDR值，节点大小显示了四个比较样本中给定猎物的相对丰度。组蛋白伴侣以粗体斜体显示。完整的点图表示可以在补充图6中看到。（B） BioID和AP-MS检测到的H2B和H3相互作用伙伴的PaxDB丰度的箱线图表示。BioID检测到的组蛋白H2B和H23的相互作用伙伴丰度显著低于AP-MS的丰度（配对双t尾t检验<0.05）。

图5
3XFLAG和BirA*-FLAG标记的介体亚单位在HEK293稳定细胞系中的T-REx Flp-in的表达水平。（A）描述介体复合体的四个模块及其蛋白质成分。（B）通过Western blot评估对照组和标记的介体亚单位的表达水平。将所示细胞系的裂解液溶解在4–15%的梯度凝胶中，并用抗FLAG M2或抗管蛋白抗体进行探测。随后，用与HRP结合的链霉亲和素重制印迹，以检测蛋白质生物素化的程度。请注意，表达MED20-BirA*-FLAG的HEK293稳定细胞系中的T-REx Flp-In没有可见的表达或额外的蛋白质生物素化，尽管MS检测到（尽管水平较低）。

图6
通过BioID和AP-MS对介体的分析显示MED4、MED20和MED23具有不同的相互作用组。（A）从AP-MS和为MED4、MED20和MED23获得的BioID数据中获得的SAINTexpress输出的层次聚类（皮尔逊相关，完全连锁聚类）。（B） SAINTexpress分析后观察到的中介复合体（方框#1）的重点。介体复合物亚基按图例着色。突出显示的方框#2与图7A相关。请注意，面板A和B中的热图中没有显示诱饵蛋白质。（C）BioID和AP-MS研究的三个介体亚基的相互作用伙伴之间重叠的总结，不包括介体亚单位本身。

图7
MED4在整个细胞周期中定位于中心体。（A） MED4的BioID和AP-MS分析显示与中心体蛋白有显著关联。图6所示热图中高亮显示的方框#2。（B） BirA*-FLAG标记的MED4显示出与间期细胞中心体定位一致的强免疫荧光染色（顶部面板）。BirA*-FLAG标记的MED23仅在细胞核中观察到，而在中心体中没有观察到（下图）。3XFLAG-MED4通过免疫荧光在间期细胞（顶部面板）和分裂细胞（底部面板）中与两个中心体标记物，即中心蛋白（C）和中心蛋白（D）共同定位。

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