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.2014年9月24日；34(39):13139-50.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2591-14.2014。

星形胶质细胞Gq-GPCR-连接的IP3R-依赖性Ca2+信号在体内不介导小鼠视皮层的神经血管偶联

丹尼尔·邦德 1, 肯·D·麦卡锡 2
附属公司

星形细胞Gq-GPCR连接的IP3R依赖性Ca2+信号传导在体内不介导小鼠视觉皮层的神经-血管耦合

丹尼尔·邦德等。 神经科学. .

摘要

局部血流受到调节，以响应神经元活动模式的变化（Roy和Sherington，1890），这一过程称为神经血管耦合。有人提出，驱动这一过程的中枢细胞途径是星形胶质细胞Gq-GPCR-连接的IP3R-依赖性Ca（2+）信号，尽管这一假说的体内试验在很大程度上缺乏。我们使用多光子激光扫描显微镜和能够在体内选择性操纵星形细胞信号通路的新型遗传工具，研究了星形细胞Gq-GPCR和IP3R-依赖性Ca（2+）信号对清醒、轻度镇静、有反应的小鼠皮层血流量的影响。用hM3Dq DREADD（设计药物专门激活的设计受体）设计受体系统选择性刺激星形细胞Gq-GPCR级联和下游Ca（2+）信号，不足以调节基底皮质血流量。尽管使用最敏感的钙指示剂cyto-GCaMP3和Lck-GCaMP6s对邻近小动脉进行了有力的扩张，但我们没有发现生理视觉刺激后可观察到星形胶质细胞终末Ca（2+）升高的证据。当意外吹气诱发惊吓反应时，可诱发星形细胞Ca（2+）升高。然而，惊吓诱导的星形胶质细胞Ca（2+）信号并不先于相应的惊吓诱导血流动力学变化。此外，在遗传上缺乏星形细胞IP3R依赖性Ca（2+）信号传导（IP3R2-KO）的轻度镇静、反应性小鼠中，神经-血管偶联是完整的。这些数据表明，星形胶质细胞Gq-GPCR-连接的IP3R-依赖性Ca（2+）信号不介导清醒、轻度镇静、反应性小鼠视觉皮层的神经血管偶联。

关键词：DREADD公司；IP3；星形胶质细胞；血流；钙；体内试验。

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数字

图1。
图1。
使用AAV载体表达转基因不会导致持续的星形细胞反应或小胶质细胞活化。A类视觉皮层细胞核（DAPI，蓝色）、星形胶质细胞GFAP（绿色）和Lck-GCaMP6s（灰色）的荧光免疫标记。对，AAV注射皮层。左，同一动物的未注射皮层。B类，与中的图像相同A类但仅用GFAP在AAV注射和未注射的皮质中更清楚地显示出类似的稀疏标记。C类AAV注射和针头穿透中心附近视皮层细胞核（DAPI，蓝色）、星形胶质细胞GFAP（绿色）和Lck-GCaMP6s（灰色）的荧光免疫标记。对，仅限GFAP。D类视觉皮层细胞核（DAPI，蓝色）、小胶质细胞（Iba1，红色）和Lck-GCaMP6s（灰色）的荧光免疫标记。对，AAV注射皮层。左，同一动物的未注射皮层。E类，与中的图像相同D类但仅使用Iba1，在注射AAV和未注射AAV的皮质中更清楚地显示出类似的粗大小胶质细胞形态。比例尺：A类,B类500微米；C类250微米；D类,E类，50微米。
图2。
图2。
基底皮质血流不受星形细胞hM3Dq刺激的影响。A类，星形细胞Lck-GCaMP6s（灰色）和血管内罗丹明（蓝色）的现场图像，显示星形细胞末梢（黑色箭头）和皮质小动脉（蓝色箭头）。B类，使用网格分析（参见材料和方法）对Lck-GCaMP6s进行无偏采样，结果显示基础星形细胞Ca稳定2+动力学。C类，不同基础星形细胞钙的代表性示例2+Lck-GCaMP6s检测到的信号(n个=3只小鼠，132个ROI）。D类，平均基础星形细胞单峰钙2+Lck-GCaMP6s检测到的高程(n个=3只小鼠，92 Ca2+信号）。E类，基础星形细胞单峰钙直方图2+Lck-GCaMP6s检测到的高程(n个=3只小鼠，92 Ca2+信号）。F类、不同类型星形细胞钙的代表性痕迹2+在相同的CNO试验中，通过调整CNO剂量和基础血流量可以诱发的反应（黑色痕迹）（蓝色痕迹）。G公司、平均血流（蓝色实线；n个=6只小鼠，37次试验），在CNO诱导的星形细胞振荡样钙2+信号（黑线；n个=6只小鼠，37 Ca2+标高）。虚线和蓝色虚线分别是车辆注射试验和基线（无注射）试验的平均值。小时，信息与相同D类但在CNO诱导的星形细胞平台样钙2+信号(n个=7只小鼠，7次试验）。虚线和蓝色虚线分别是车辆注射试验和基线（无注射）试验的平均值。我，平均皮质血流量增加(n个=7只小鼠，379次刺激试验）。虚线轨迹在无刺激试验期间(n个=7只小鼠，384次试验）。比例尺：A类，20微米。中的着色区域D类,G–I代表SEM。
图3。
图3。
小鼠视觉皮层星形胶质细胞不显示可观察到的体细胞钙2+视觉刺激后的仰角。A类，显示加载OGB-1（灰色）/SR-101（蓝色）染料的第II/III层神经元和星形胶质细胞的现场图像。将漂移光栅视觉刺激呈现给轻度镇静、反应灵敏的小鼠。B类，刺激呈现期间，视觉反应神经元（黑色痕迹）、星形胶质细胞（蓝色痕迹）和视觉无反应神经元（灰色痕迹）的细胞体周围绘制的ROI荧光信号的代表性痕迹（垂直灰条）。C类，平均神经元Ca2+增加视觉刺激(n个=4只小鼠，87个细胞，3132次刺激试验）。D类，平均星形细胞钙2+视觉刺激期间的动力学(n个=4只小鼠，35个细胞，1152次刺激试验）。E类、平均星形细胞（蓝色）和无反应神经元（灰色，n个=4只小鼠，82个细胞，3132次刺激试验）Ca2+视觉刺激期间的动力学，表明神经膜信号的污染。比例尺：A类，20微米。对于C–E类，刺激是在由黑条指示的时间范围内呈现的，虚线表示没有刺激试验，阴影区域表示SEM。
图4。
图4。
皮层小动脉在缺乏钙的情况下扩张2+血管周围星形胶质细胞终末升高。A类，细胞-GCaMP3（灰色）和血管内罗丹明（蓝色）的现场图像，显示星形细胞末梢（黑色箭头）和皮质小动脉（蓝色箭头）。B类，使用网格分析（参见材料和方法）对细胞-GCaMP3进行无偏采样，结果显示基础星形细胞Ca稳健2+动力学。C类，平均基底星形胶质细胞单峰Ca2+cyto-GCaMP3检测到升高(n个=3只小鼠，94 Ca2+信号）。D类，平均基础星形细胞单峰钙2+cyto-GCaMP3（黑色痕迹）和Lck-GCaMP6s（灰色痕迹；图2D类)，归一化为各自的最大值。E类，细胞-GCaMP3检测到的基础单峰振幅直方图(n个=3只小鼠，94 Ca2+信号）。F类，基于小动脉扩张（蓝色痕迹）和星形胶质细胞末端Ca的血流变化的代表性同步测量2+视觉刺激期间的动态（黑色痕迹）（垂直灰色条）。前三个轨迹分别来自使用cyto-GCaMP3的实验。底部痕迹来自使用Lck-GCaMP6的实验。G公司，平均血流（蓝色痕迹，n个=9只小鼠，464次刺激试验）和星形胶质细胞末端Ca2+（黑色痕迹，n个=9只小鼠，464次刺激试验，来自细胞-GCaMP3和Lck-GCaMP6s实验）在5 s长视觉刺激（黑条）后的动力学。小时、平均血流（蓝色痕迹；n个=5只小鼠，187次刺激试验）和星形胶质细胞末端Ca2+（黑色痕迹；n个=5只小鼠，187次刺激试验，来自细胞-GCaMP3和Lck-GCaMP6s实验）在20 s长视觉刺激（黑条）后的动力学。我、平均血流（蓝色痕迹）和星形胶质细胞末梢钙2+通过高速多光子线扫描评估（黑迹，Lck-GCaMP6s）动力学(n个=3只小鼠，183次刺激试验），接受5 s长的视觉刺激（黑条）。比例尺：A类，20微米。中的着色区域C类,G–I代表SEM。
图5。
图5。
喷气惊吓引起广泛的星形细胞钙2+升高和皮质血流量变化。A类、喷气（黑匣子）惊吓性星形细胞Ca的无偏采样2+（Lck-GCaMP6s）信号，采用全场网格分析（见材料和方法）。B类，星形细胞Ca直方图2+气流冲击后的仰角振幅(n个=5只小鼠，46次刺激试验）。C类、平均血流变化（蓝色痕迹）和星形胶质细胞末梢钙2+吸气惊吓后的信号（黑色轨迹，Lck-GCaMP6s），用黑色条表示(n个=5只小鼠，46次刺激试验）。中的着色区域C类代表SEM。
图6。
图6。
轻度镇静、反应性IP的视觉皮层中的神经血管耦合完整三R2 KO小鼠。A类，对视觉刺激有反应的神经元百分比（OGB-1阳性/SR-101阴性）(n个=每个基因型4只小鼠；野生型，n个=169个细胞总数；让开，n个=177个单元格；学生的t吨测试，第页= 0.7328).B类，平均神经元Ca2+野生型增加（蓝色；n个=4只小鼠，87个细胞，3132次刺激试验）和IP三R2 KO（红色；n个=4只小鼠，88个细胞，3168次刺激试验），接受5 s长的视觉刺激（黑条）。虚线轨迹是没有刺激的试验的平均值。C类，平均星形细胞钙2+野生型（蓝色；n个=4只小鼠，35个细胞，1152次刺激试验）和IP三R2 KO（红色；n个=4只小鼠，30个细胞，1080次刺激试验）。虚线轨迹是没有刺激的试验的平均值。Inset还显示了野生型（蓝色虚线轨迹）和IP三R2 KO（红色虚线迹线）无反应神经元Ca2+视觉刺激期间的信号，表示神经膜信号的污染。D类，野生型（蓝色；n个=7只小鼠，379次刺激试验）和IP三R2 KO（红色；n个=8只小鼠，414次刺激试验）。虚线轨迹是没有刺激的试验的平均值。E类，野生型（蓝色；n个=7只小鼠，189次刺激试验）和IP三R2 KO（红色；n个=6只小鼠，227次刺激试验）。虚线轨迹是没有刺激的试验的平均值。中的误差线A类和中的阴影区域B–E类代表SEM。
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