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。2014年10月23日；56(2):205-218.
doi:10.1016/j.molcel.2014.08.018。 Epub 2014年9月18日。

天门冬氨酸在调节细胞对谷氨酰胺缺乏的适应中起着关键作用

Ji Zhang先生 1, 京凡 2, 斯里拉姆·维内蒂 1, 贾斯汀·克罗斯 三, 高木俊美 4, 巴夫尼特·宾德 4, 哈基姆·贾巴拉 4, 卡奈Masayuki 5, 艾米丽·郑 5, 亚历山大·朱德金斯 6, 布鲁斯·帕维尔 7, 朱莉·巴格斯 8, 萨拉·切里 9, 约书亚·D·拉比诺维茨 2, 克雷格·B·汤普森 10
附属公司

天门冬氨酸在调节细胞对谷氨酰胺缺乏的适应中起着关键作用

Ji Zhang先生等。 分子电池。 。

摘要

许多癌细胞消耗大量谷氨酰胺来维持TCA循环的恢复和支持细胞生存。因此，令人惊讶的是，RNAi筛选显示，柠檬酸合成酶（CS）是第一种TCA循环酶，其抑制可阻止谷氨酰胺诱导的细胞凋亡。CS抑制降低TCA循环活性，并将CS底物草酰乙酸转移到非必需氨基酸天冬氨酸和天冬酰胺的生成中。我们发现，天冬酰胺是必要的，足以抑制谷氨酰胺诱导的凋亡，而不会恢复其他非必需氨基酸或TCA循环中间产物的水平。在完全培养基中，当谷氨酰胺依赖性天冬酰胺合成受到抑制时，谷氨酰胺消耗率高的肿瘤细胞发生快速凋亡，天冬酰胺合成酶的表达与人类肿瘤的不良预后具有统计学相关性。再加上L-天冬酰胺酶作为儿童白血病治疗方法的成功，数据表明，细胞内天冬酰胺是许多人类肿瘤细胞凋亡的关键抑制剂。

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数字

图1
图1。谷氨酰胺缺乏通过BCL2蛋白和caspase诱导凋亡细胞死亡
（A） 野生型（WT）和Bax公司−/−;贝克−/−（DKO）MEF在不含谷氨酰胺的DMEM中培养4天。Annexin V阳性染色确定死亡细胞百分比。数据表示为平均值+/-S.D.，n=3。（B） 在20µM Q-VD存在下，将SF188细胞与谷氨酰胺或不与谷氨酰胺培养48小时。用识别N末端暴露、活化BAX（绿色）和Hoechst核染色（蓝色）的抗体对细胞进行染色。谷氨酰胺缺乏24小时后SF188细胞中细胞色素C的释放和caspase-3的激活。VDAC被用作线粒体分数的标记。（E，F）具有组成型过表达BCL-X的SF188细胞L（左）谷氨酰胺饥饿48小时。收集细胞进行Annexin V和PI染色或caspase-3活化的western blotting。（G） 将SF188细胞在含有或不含泛酶抑制剂Q-VD（20µM）的情况下剥夺谷氨酰胺48小时。图像是用Leica DM IRBE荧光显微镜在40X的亮场下拍摄的。
图2
图2。高通量RNAi筛选确定柠檬酸合成酶（CS）siRNA是谷氨酰胺提取诱导凋亡的抑制剂
（A） MYC-扩增SF188人胶质母细胞瘤细胞系筛选策略示意图。每个板的右下角是阳性和阴性对照物的位置。（B） 重复执行主屏幕的稳健z评分散点图。蓝色：不含谷氨酰胺的总库siRNA；绿色：阴性对照siRNA或无无谷氨酰胺的siRNA；黄色：不含谷氨酰胺的针对MYC或BAX的阳性对照siRNA；红色：谷氨酰胺干扰小干扰RNA阳性对照。“−”或“+”Q表示谷氨酰胺状态。虚线：每个数据的实际值与回归值之差的标准偏差（σ）的±2倍。（C） 119名候选人的二次筛选。有关断点截止的定义，请参见扩展的实验程序。另请参见图S1。
图3
图3。CS功能丧失保护细胞免受谷氨酰胺提取诱导的凋亡
（A） SF188细胞用mitoTracker红（红色）染色，然后固定并用CS抗体（绿色）染色。采用DAPI（蓝色）进行细胞核染色。分离出SF188细胞的胞浆和重膜部分。通过western blotting证实CS的分布，VDAC和α-微管蛋白作为线粒体和细胞溶质标记物。（B） 对SF188细胞中CS的siRNA抑制48小时会降低蛋白质水平和酶活性。用对照或CS siRNA转染（C，D）SF188细胞2天，再剥夺谷氨酰胺48小时。通过Annexin V和PI染色测定存活率。在谷氨酰胺耗尽4天后，再添加谷氨酰胺2天后，用结晶紫染色法测量活细胞总数。（E） 在含有谷氨酰胺的DMEM培养基中用对照、CS或MYC siRNA转染SF188细胞，记录转染后第2天到第5天的细胞数量。（F） 将含有组成性表达的小鼠CS（mCS）或空载体（pCDH）的SF188细胞转染对照或人CS siRNA 2天，然后剥夺谷氨酰胺48小时。用Annexin V和PI染色测定活性，用western blotting测定总CS的表达。p值通过Student的双尾t检验确定。（G） 将对照或丙酮酸脱氢酶亚单位α（PDHα）siRNA转染SF188细胞2天，然后去除谷氨酰胺48小时。通过Annexin V和PI染色测定存活率。图3中的数据（B、C、E、F和G）显示为平均值+/-S.D.，n=3。另请参见图S2。
图4
图4。CS敲除将草酰乙酸（OAA）重定向到天冬氨酸和天冬酰胺合成
（A，B）SF188细胞被剥夺谷氨酰胺16小时。测定活细胞中NAD、NADH和ATP的总水平，并将其归一化为细胞数。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。（C） 用对照或CS siRNA转染SF188细胞2天，然后在含有（+Q）或不含（−Q）谷氨酰胺的DMEM培养基中培养16小时。细胞内柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐和天冬氨酸/天冬酰胺通过LC-MS进行定量，并归一化为细胞蛋白质含量。数据表示为平均+/-S.D.，n=3，p值通过Student的双尾t检验确定。（D） 示意图显示，CS敲除将OAA重定向到天冬氨酸和天冬酰胺生物合成。缩写：Glc，葡萄糖；丙酮酸；Ac-CoA，乙酰-CoA；谷氨酰胺；谷氨酸；Cit，柠檬酸盐；α-KG，α-酮戊二酸；琥珀酸；富马酸；苹果酸；草酰乙酸；天冬氨酸、天冬氨酸；天冬酰胺。另请参见图S3。
图5
图5。在缺乏谷氨酰胺的情况下，细胞外天冬酰胺完全恢复活力，但不能恢复TCA循环中间产物、其他非必需氨基酸或增殖
（A） SF188细胞在DMEM中培养48小时，修饰如下：+Gln，−Gln，–Gln+αKG（5 mM）和–Gln+Asn（4 mM）。通过Annexin V和PI染色测定存活率。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。（B） SF188细胞在不含谷氨酰胺的DMEM中，在不同浓度的天冬酰胺存在下培养4天。通过Annexin V和PI染色测定存活率。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。（C） SF188细胞在DMEM中以以下修饰生长：+Q，−Q+N（4 mM）和−Q+αKG（5 mM）3天，并记录细胞数量。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。p值通过Student的双尾t检验确定。（D） SF188细胞在与面板（A）相同的条件下培养16小时。细胞内柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸和富马酸通过GC-MS定量，并归一化为细胞蛋白质含量。数据显示为平均值+S.D.，n=3。（E） SF188细胞在与面板（A）相同的条件下培养16小时。细胞内丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）水平通过LC-MS进行量化，并归一化为细胞总体积。数据显示为平均值+S.D.，n=3。（F） SF188细胞在不含谷氨酰胺（−Q）的DMEM中培养，分别添加0.2 mM丙氨酸（−Q+A）、谷氨酸（−Q+E）、脯氨酸（−Q+P）、天冬氨酸（−Q+D）或天冬酰胺（−Q++）。凋亡诱导百分比通过培养基改变后2天的膜联蛋白V阳性染色来定义，然后减去凋亡率的基础水平（在含有谷氨酰胺的完全DMEM中生长的细胞）。数据显示为平均值+S.D.，n=3。另请参见图S4。
图6
图6。天冬酰胺合成酶（ASNS）的表达是谷氨酰胺依赖性生存所必需的，并与人类神经胶质瘤的不良预后相关
（A） 用靶向ASNS或对照的siRNA转染SF188细胞2天。蛋白印迹证实ASNS的敲除。（B） 用对照或ASNS siRNA转染SF188细胞48小时，然后在含有或不含细胞外天冬酰胺（4mM）的谷氨酰胺的DMEM中培养。从转染后第2天到第5天，通过台盼蓝染色测定细胞死亡。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。（C） 用对照或ASNS siRNA转染SF188细胞，并在与实验组（B）相同的条件下培养。通过台盼蓝排除法记录转染后第2天到第5天的活细胞数。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。（D） 采用免疫组织化学方法对正常脑组织或胶质瘤患者肿瘤组织进行ASNS染色。显示了每种类型的代表性图像，包括正常大脑、I级（毛细胞性星形细胞瘤，PA）、II级（弥漫性星形细胞细胞瘤，DA）、III级（间变性星形细胞瘤（AA）和IV级（胶质母细胞瘤，GBM）。提供了GBM样品ASNS染色的放大区域，显示染色的细胞质分布。箭头表示肿瘤内的血管组织没有染色。（E） 基于每个图像的像素单位对ASNS染色的强度进行量化，并对每个类别进行总结。数据显示为平均值+S.E.M.、正常大脑（n=3）、PA（n=30）、DA（n=5）、AA（n=10）、GBM（n=31）。每个类别的定义见扩展实验程序。所有p值均通过Student的双尾t检验确定。另请参见图S5。
图7
图7。天冬酰胺的添加抑制了谷氨酰胺戒断对内质网（ER）应激标记基因的诱导
（A） SF188细胞在含有（−Q+N）或不含（−Q）天冬酰胺（4mM）的完全培养基（+Q）或谷氨酰胺缺乏培养基中培养16小时，然后切换到不含蛋氨酸的相同新鲜培养基。0.1 mCi35S-蛋氨酸脉冲30分钟，制备全细胞提取物。在闪烁计数器中测量标记蛋白质的放射性，并将其归一化为总蛋白质含量。（B） 将SF188细胞在DMEM中培养48小时，并进行以下修饰：添加谷氨酰胺（+Q）、不添加谷氨酸（−Q）或不添加谷氨酰胺且存在环己酰亚胺（1µg/mL）（−Q+CHX）。通过Annexin V和PI染色测定存活率。（C） SF188细胞在无谷氨酰胺（−Q）或无谷氨酰胺但有天冬酰胺（4mM）（−Q+N）的DMEM中培养24小时。添加20µM的Q-VD以防止细胞死亡。提取mRNA并进行Q-PCR检测ER应激标记基因、CHOP、TNXIP、XBP1s、ASNS、BiP和HERPUD1的相对丰度，并将其归一化为18s核糖体RNA。在0、24和48小时制备蛋白质提取物，用于ATF4和CHOP的蛋白质印迹。以10µg/ml的浓度添加Tunicamycin（Tm）4小时，作为阳性对照。（E） 将SF188细胞切换到含有（−Q+N）或不含（−Q）天冬酰胺（4 mM）的负谷氨酰胺DMEM培养16小时。在更换培养基后0、2、6和16小时制备蛋白质提取物。对磷酸-eIF2α（S51）和总eIF2α进行蛋白质印迹。（F） 用对照或CHOP siRNA转染SF188细胞2天。然后在Q-VD（20µM）存在下提取谷氨酰胺24小时。制备全细胞提取物用于CHOP的western blotting。（G） 用对照或CHOP siRNA转染SF188细胞2天。然后取出谷氨酰胺48小时，并通过膜联蛋白V染色测量生存能力。（H） SF188细胞分别在不含谷氨酰胺（Gln）或亮氨酸（Leu）的DMEM中培养。将4 mM天冬酰胺（Asn）添加到或不添加到每个氨基酸缺乏培养基中24小时。在20µM下添加Q-VD以防止细胞死亡，并制备蛋白质提取物用于ATF4和CHOP的western印迹。图7中的数据（A、B、C和G）显示为平均值+/-S.D.，n=3，p值通过使用Student的双尾t检验确定。另见表S1。
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