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。2014年9月10日；34(37):12547-59.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0324-14.2014。

通过C/EBPβ的正性自身调节BDNF反馈环介导海马记忆巩固

Dhananjay Bambah-Mukku公司 1, 阿莱西奥·特拉瓦利亚 2, 狄龙·Y·陈 三, 加布里埃拉·波洛尼尼 2, 克里斯蒂娜·阿尔贝里尼 4
附属公司

通过C/EBPβ的正性自身调节BDNF反馈环介导海马记忆巩固

Dhananjay Bambah-Mukku公司等。 神经科学。 。

摘要

目前对记忆巩固机制的时间进程和调节知之甚少。脑源性神经营养因子（BDNF）已被证明调节记忆巩固的维持，但这种调节的机制尚不清楚。通过对大鼠进行抑制性回避（IA），我们发现通过CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）的海马BDNF阳性自动调节反馈回路对调节记忆巩固是必要的。在训练中，BDNF的快速学习诱导需求伴随着快速从头翻译，控制cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和C/EBPβ表达的持续激活诱导。后者反过来控制bdnf外显子IV转录物和bdnf蛋白的表达增加，这两者都是必需的，并且与最初的bdnf需求一起，调节记忆巩固。训练后48小时，C/EBPβ和pCREB降低，甲基-CpG结合蛋白-2、组蛋白去乙酰化酶-2和bdnf外显子IV启动子处的开关依赖性-3a结合增加，自动调节环终止。

关键词：BDNF；C/EBP；巩固；海马；记忆；内存持久性。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
记忆巩固期间海马蛋白质合成需求的时间分布。实验时间表如上图所示。A–G在指定的时间点向大鼠双侧海马注射载体或茴香霉素（箭头），以平均潜伏期±SEM（秒）表示获得（Acq.）和保留。A类IA训练前15分钟海马注射茴香霉素对训练后1小时测试的短期记忆没有影响(n个=8/组，试验1，载药与茴香霉素，第页>0.05，学生的t吨测试）。B类，IA训练前15分钟海马注射茴香霉素会干扰训练后2天和7天的记忆测试(n个=8–9/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页<0.01，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(1,28)= 22.37,第页<0.0001）以及脚部电击提醒后1天（试验3，载药与茴香霉素，第页<0.01，学生的t吨测试）。测试1、测试2或测试3的记忆保持时间与采集延迟没有显著差异(第页>0.05，学生的t吨测试）。C类IA训练后立即海马注射茴香霉素，训练后第2天和第7天测试记忆中断(n个=8/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页<0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；治疗效果F类(1,28)= 13.79,第页=0.0009）以及脚部电击提醒1天后（试验3，载药与茴香霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。测试1的记忆保持率与采集延迟显著不同(第页<0.05，学生的t吨测试）。D类IA训练后第1天海马注射茴香霉素对注射后第2天的记忆测试没有影响(n个=10/组，试验1，载药与茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）但在注射后7天重新测试的显著中断的记忆（测试2，第页<0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(1,36)= 5.277,第页= 0.0275). 学生的t吨将茴香霉素组的测试2与其相对获得潜伏期进行比较的测试显示出统计学上的显著差异（Student’st吨测试，第页= 0.0210).E类IA训练后第1天海马注射茴香霉素显著干扰了注射后第7天测试的记忆(n个=8/组，试验1，载药与茴香霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。学生的t吨将茴香霉素组的测试1与其相对获得潜伏期进行比较的测试显示出统计学上的显著差异（Student’st吨测试，第页=0.0412）。F类训练后2天海马注射茴香霉素对注射后2天（测试1）或7天（测试2）的记忆测试没有影响(n个=12–14/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的两个实验的测试）。G公司训练后第7天海马注射茴香霉素对注射后第2天（测试1）、第7天（测试2）或第21天（测试3）的记忆力没有影响(n个=8–9/组，试验1、试验2和试验3，溶媒vs茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图2。
图2。
长期记忆巩固需要快速雷帕霉素敏感期。每个图上方的实验时间表(A–C). 采集（Acq.）和保留表示为平均潜伏期±SEM（秒）。箭头表示IA训练前15分钟或训练后立即双侧海马注射载体或雷帕霉素。与车辆相比，训练前15分钟注射雷帕霉素(A类)不影响短期记忆(n个=7/组，溶媒vs雷帕霉素，第页>0.05，学生的t吨测试），但(B类)在测试1和测试2中完全中断记忆保持(n个=7/组，试验1，载药与雷帕霉素，第页<0.01雷帕霉素；试验2，载药与雷帕霉素，第页<0.05，双向方差分析后为Bonferroni临时的测验；处理效果F类(1,24)= 19.77,第页=0.0002，与Acq.相比，每个雷帕霉素组。，第页>0.05学生的t吨测试）。提示电击后记忆没有恢复（测试3，车辆与雷帕霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。C类，训练后立即注射雷帕霉素对记忆保持没有影响(n个=9–10/组，试验1和试验2，载药与雷帕霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图3。
图3。
长期记忆巩固期间海马BDNF需求的时间分布。每个图上方的实验时间表。在指定的时间点双侧海马注射IgG、抗BDNF或TrkB-Fc大鼠的获得（Acq.）和保持用平均潜伏期±SEM（秒）表示(A–E).A类在IA训练前15分钟海马注射抗BDNF或TrkB-Fc显著干扰训练后2天和7天测试的记忆(n个=8–9/组，IgG vs抗BDNF或vs TrkB-Fc试验1，第页<0.01和试验2，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(2,46)= 17.08,第页<0.0001）以及脚震提示后1天（试验3，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc，两种治疗第页<0.01，Newman–Keuls多重比较的单因素方差分析临时的测验；处理效果F类(2,25)= 8.174,第页= 0.0021).B类训练后立即海马注射抗BDNF或TrkB-Fc对注射后第2天的记忆测试没有显著影响(n个=8–10/组，试验1，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的但在注射后第7天重新测试了记忆（测试2，抗BDNF和TrkB-Fc，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试；处理效果F类(2,48)= 12.93,第页< 0.0001). 在提醒电击后，显著损伤持续存在（测试3，两种治疗第页<0.001，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较临时的测验；处理效果F类(2,26)= 9.958,第页= 0.0007).C类IA训练后第1天海马注射TrkB-Fc对注射后第2天的记忆测试没有影响(n个=8–9/组，试验1，3 d，IgG vs TrkB-Fc第页>0.05，学生的t吨测试），但注射后7天测试的记忆力明显受损(n个=7–8/组，试验1，8 d，IgG vs TrkB-Fc第页<0.05，学生的t吨测试）。D类IA训练后2天海马注射抗BDNF或TrkB-Fc对注射后2天（测试1）或7天（测试2）测试的记忆没有影响(n个=6–9/组，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc第页> 0.05; 双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）。E类IA训练后第7天海马注射抗BDNF对注射后第2天（测试1）、第7天（测试2）或第14天（测试3）测试的记忆没有影响(n个=7/组，IgG vs抗BDNF第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.
图4。
图4。
训练时海马BDNF需要增加pCREB、pCofilin、pCaMKIIα和C/EBPβ。A类幼年大鼠和训练大鼠在训练前15分钟给予海马注射IgG或抗BDNF，训练后12小时处死，其背海马提取物的示例和密度定量Western blot分析。训练后，pCREB、pCofilin、pCaMKIIα和C/EBPβ的表达显著增加，这种增加被抗BDNF注射显著阻断(n个=6–12/组，天真vs训练-IgG，天真vs.训练-抗-BDNF，单因素方差分析，然后是纽曼-凯尔斯多重比较临时的测验；pCREB公司：F类(2,30)= 7.608,第页= 0.0023; pCofilin公司：F类(2,20)= 5.796,第页= 0.0114; pCaMKIIα：F类(2,32)= 8.621,第页= 0.0011; C/EBPβ：F类(2,23)= 5.308,第页= 0.0136). 总CREB、总CaMKIIα或总Cofilin水平无明显变化(第页>0.05，数据未显示）。数据表示为注射IgG的平均百分比±SEM原始对照*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.B类，该图总结了IA训练前15分钟注射抗BDNF抗体或对照IgG抗体的大鼠海马背侧提取物中训练依赖性pCREB和pCaMKIIα增加的时间曲线(n个=5–8/组），训练后30分钟或12小时或20小时死亡。除了此处研究的12小时时间点外，这些图表还包括之前报告的30分钟和20小时的数据（Chen等人，2012）。密度定量Western blot分析数据表示为平均百分比±SEM原始，注射IgG的对照组在匹配的时间点死亡。所有数值均根据肌动蛋白进行标准化。与注射IgG（浅灰色圆圈）的原始对照组相比，在IA中训练的大鼠在训练后30分钟、12和20小时（黑色方块）表现出显著的海马pCREB和pCaMKIIα诱导。训练前15分钟海马内注射抗BDNF可阻断所有三个时间点pCREB的诱导以及12小时和20小时（而非30分钟）pCaMKIIα的诱导（深灰色三角形；单向方差分析，然后Newman–Keuls多重比较临时的测试）*表示Naive-IgG组与Trained-IgG组的显著性水平比较*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001. #表示训练性IgG组与训练性抗-BDNF组之间的显著性水平比较#第页<0.05时##第页<0.01，以及###第页< 0.001.
图5。
图5。
BDNF在自动调节-正反馈回路中招募C/EBPβ。A类，qRT-PCR分析bdnf外显子IV在指定时间点处死的训练大鼠的背海马cDNA（标准化为gapdh公司). 与幼稚相比，训练显著增加bdnf外显子IV训练后12小时和20小时的水平(n个=4-8/组；12小时，第页< 0.05; 20小时，第页< 0.01; 单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较临时的测试）。无增加bdnf外显子IV暴露于环境和电击1h后12h，大鼠海马出现水平（未配对方案）。数据表示为平均褶皱变化±SEM。B类，Bdnf外显子IVAS（而不是SCR ODN）中断了内存整合。实验时间表如上图所示。IA训练后6小时注射ODN（箭头所示）。训练后第2天（测试1）和第7天（测试2）对大鼠进行测试。与SCR相比，AS显著降低了测试1和测试2的记忆保持力(n个=9–10/组；AS与SCR，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(1,51)= 29.14). 脚部电击提醒后，未观察到明显的恢复(第页> 0.05). 数据表示为平均潜伏期±SEM***第页< 0.001.C类、琼脂糖凝胶中经溴化乙锭染色的代表性PCR片段和显示qRT-PCR的图表bdnf外显子IV在ChIP后获得带有抗C/EBPβ的启动子。这些碎片是从训练后30分钟、12小时或48小时处死的训练大鼠的背侧海马获得的。培训导致C/EBPβ与bdnf外显子IV促进者训练后12小时(n个=4/组；幼稚vs训练有素，12小时，第页<0.05，单因素方差分析，然后是Dunnett的多重比较临时的测试；F类(3,15)=3.998，第页= 0.0346). 数据表示为平均输入富集百分比±SEM。D类，qRT-PCR分析bdnf外显子IV训练后5小时在幼稚和训练过的大鼠海马内注射SCR-ODN或β-ODN（箭头），训练后12小时处死（正常化为gapdh公司). 培训显著增加bdnf外显子IV12小时时的水平；这种增加被β-ODN阻断(n个=6–8/组；幼稚的SCR-ODN与训练有素的SCR-DON第页<0.01，经训练的SCR ODN与经训练的β-ODN第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较临时的测验；F类(2,21)= 8.136,第页= 0.0028). 数据表示为平均褶皱变化±SEM。E类在训练后5小时注射SCR-ODN或β-ODN，并在训练后20小时处死（归一化为肌动蛋白）的幼稚和训练大鼠背海马提取物中BDNF蛋白水平的Western blot示例和密度定量Western blot分析。训练后20小时BDNF水平显著增加；这种增加被β-ODN阻断(n个=6–8/组；幼稚的SCR-ODN与训练有素的SCR-DON，训练有余的SCR-OON与训练过的β-ODN第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较临时的测验；F类(2,20)=5.568，第页= 0.0131). 数据表示为注射SCR-ODN的平均百分比±SEM原始对照。F类，qRT-PCR分析bdnf外显子IV在训练前15分钟注射IgG或抗BDNF抗体（箭头），并在训练后12小时处死幼年和训练大鼠的背海马cDNA（归一化为gapdh公司). 抗BDNF阻断了依赖训练的bdnf外显子IV(n个=8–12/组；初始IgG与训练过的IgG以及训练过的IgG与训练过的抗BDNF第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较临时的测验；F类(2,27)= 4.949,第页= 0.0155). 数据表示为平均褶皱变化±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图6。
图6。
训练后C/EBPβ或BDNF阻断导致的记忆障碍被BDNF挽救。数据表示为平均潜伏期±SEM。实验时间表如上图所示(A–F).A类IA训练后5h注射Rec-BDNF而非Rec-NT3，可缓解C/EBPβ表达受阻引起的记忆障碍。在IA训练后5 h注射β-ODN或SCR-ODN，以及rec-BDNF、rec-NT3或Vehicle。在注射后2天（测试1）或7天（测试2）对大鼠进行测试。与SCR-ODN相比，β-ODN在训练后第2天和第7天显著降低记忆保持力(n个=6–8/组；SCR-ODN/VEH与β-ODN/VEH-，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(4,58)= 13.73,第页< 0.0001). BDNF（而非NT3）显著且完全地挽救了这一失忆症，并且挽救效果持续存在（β-ODN/VEH vsβ-ODN/BDNF，第页< 0.001; β-ODN/VEH与β-ODN/NT-3的比较，第页> 0.05; SCR-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测试）。B类，在IA训练后12小时注射Rec-BDNF而不是Rec-IGF-II，显著且完全地挽救了训练后5小时注射β-ODN引起的记忆损伤(n个=6–11/组，β-ODN/VEH vsβ-ODN/BDNF，第页< 0.001; β-ODN/VEH与β-ODN/IGFII的比较，第页> 0.05; SCR-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(2,34)= 13.51,第页< 0.0001). 在注射后2天（测试1）或7天（测试2）对大鼠进行测试。C类，D类，注入Rec-BDNF 2 d(C类)或4天(D类)训练后不能挽救因阻断C/EBPβ表达而引起的记忆障碍。IA训练后5 h注射β-ODN或SCR-ODN。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=6–8/组；β-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；治疗效果：用于C类，F类(2,34)= 13.51,第页< 0.0001; 对于D类，F类（2，40）= 46.42,第页< 0.0001),E类在IA训练后12 h注射Rec-BDNF并不能挽救因预训练抗BDNF而引起的记忆损伤。训练前15分钟注射IgG或抗BDNF抗体（箭头）。训练后12小时注射Rec-BDNF或车辆（箭头所示）。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=6–7/组；抗BDNF/VEH与抗BDNF/BDNF，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(2,32)= 41.39,第页< 0.0001).F类在IA训练后12小时注射Rec-BDNF挽救了训练后注射抗BDNF引起的记忆衰退。训练后立即注射IgG或抗BDNF抗体（箭头所示）。训练后12小时注射Rec-BDNF或Vehicle（箭头所示）。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=9–10/组；抗BDNF/VEH与抗BDNF/BDNF，试验2，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni临时的测验；处理效果F类(2,50)=8.36，第页= 0.0007); ***第页< 0.001.
图7。
图7。
阻遏物/激活物结合率增加bdnf外显子IV启动子与反馈回路的终止有关。A类，226bp上游区域方案bdnf外显子IV用ChIP分析启动子。B类、琼脂糖凝胶中经溴化乙锭染色的代表性PCR片段和(C类——F类)qRT-PCR分析bdnf外显子IV使用针对pCREB、MeCP2、HDAC2或Sin3a的抗体在ChIP之后的启动子片段。qRT-PCR取自训练后30分钟、12小时或48小时处死的训练大鼠的背侧海马。数据以平均输入富集百分比±SEM表示(n个=4–7/组；第页< 0.05,第页<0.01，单因素方差分析，然后是Dunnett的多重比较临时的测试；pCREB公司：F类(3,15)= 5.437,第页= 0.0136; MeCP2：F类(3,15)= 7.069,第页= 0.0054; 巴格达2：F类(3,19)= 5.960,第页= 0.0063; Sin3a：F类(3,15)= 5.842,第页= 0.0104).G公司，转录调控的示意模型bdnf外显子IVIA培训后的推广人。训练中的BDNF导致pCREB和C/EBPβ结合增加bdnf外显子IV启动子在IA训练后12小时，这与bdnf外显子IV以及BDNF蛋白（图5）。训练后48小时，pCREB和C/EBPβ在bdnf外显子IV启动子返回基线，而抑制剂Sin3a、MeCP2和HDAC2的结合随着BDNF水平返回基线而增加*第页< 0.05, **第页< 0.01.
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