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.2014年12月；76（6）：845-61。
doi:10.1002/ana.24271。 Epub 2014年9月26日。

衰老大脑中血管旁清除通路受损

本杰明·特克雷斯 1, 杰弗里·伊利夫, 茂盛夏, 王明桓, 海伦·S·魏, 道格拉斯·齐彭菲尔德, 谢露露, 弘毅康, 徐启武, 杰森·A·赖, 本杰明·阿普洛格, 冯菲丁, 拉希德·迪恩, Maiken Nedergaard公司
附属公司

衰老大脑中血管旁清除通路受损

本杰明·特克雷斯等。 神经病学年鉴. 2014年12月.

摘要

目标：在大脑中，蛋白质废物的清除部分是通过血管旁通路进行的，这些通路促进了脑脊液（CSF）和间质液（ISF）之间的水和可溶性物质的对流交换。几项证据表明，通过淋巴系统的大量引流是由脑血管搏动驱动的，并依赖于血管旁CSF通路中的星形胶质细胞水通道。本研究的目的是评估老化大脑中CSF-ISF交换和间质溶质清除的效率是否受损。

方法：通过体内和体外荧光显微镜评估CSF-ISF交换，通过放射性示踪物清除试验评估年轻（2-3个月）、中年（10-12个月）和老年（18-20个月）野生型小鼠的间质溶质清除。通过免疫荧光法评估星形细胞水通道水通道蛋白-4（AQP4）表达的年龄相关性变化与glymphatic通路功能变化之间的关系。

结果：年龄增长与蛛网膜下腔CSF和脑实质之间的交换效率显著下降有关。相对于年轻小鼠，老年小鼠实质内注射淀粉样蛋白-β的清除率受损40%。皮质内小动脉血管壁搏动性降低27%，穿透动脉血管周围AQP4极化广泛丧失，伴随着脑脊液-脑脊液交换减少。

解释：我们认为，受损的glymphatic清除导致老年人认知能力下降，可能是治疗与错误折叠蛋白聚集体积累相关的神经退行性疾病的一个新的治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明他们没有相互竞争的利益冲突

数字

图1
图1。血管旁淋巴液脑脊液再循环和间质溶质流出的年龄依赖性下降
（A）将小分子量（德克萨斯红结合右旋糖酐，3 kD；Dex-3）和大分子量示踪剂（卵清蛋白结合ALEXA-647，45 kD；OA-45）注入年轻（2-3个月）、中年（10-12个月）和老年（18个月）小鼠的脑池内。（B）注射后30min，对动物进行灌注固定，并评估全片荧光。与年轻大脑相比，老年大脑的脑脊液示踪剂穿透率显著降低，而中年大脑的值处于中等水平（*P<0.05，***P<0.001；单因素方差分析；每组n=5-8）。（C）典型图像显示，与年轻大脑相比，脑脊液示踪剂进入中老年大脑的速度明显减慢。（D）无线电标记125I-淀粉样β1–40和14将C-菊粉联合注射到年轻、中年和老年小鼠的尾状核内。注射后60min，通过γ计数和液体闪烁计数评估溶质清除率。（E）与年轻大脑中的清除率相比，125I-淀粉样β1–40和14月龄大脑中的C-菊粉清除率显著受损（***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，单因素方差分析；每组n=6-11）。125I-淀粉样β1–40和14中年大脑中的C-菊粉清除率介于年轻大脑和老年大脑之间。
图2
图2。体内2光子成像显示衰老小鼠血管旁淋巴结CSF再循环受到抑制
（A）脑池内注射FITC-共轭葡聚糖（40 kD，Dex-40）后，通过活体双光子显微镜评估血管旁脑脊液示踪剂对小鼠皮层的渗透。（B）大脑皮层表面以下100µm处脑脊液示踪剂穿透的定量显示，与年轻大脑皮层相比，中年人的血管旁穿透受损（*P<0.05，双向重复测量方差分析；每组4只动物）。（C-D）脑池内注射Dex-40后，在皮层表面和皮层表面以下100µm处进行连续体内双光子成像。通过动脉注射德克萨斯红结合右旋糖酐（70kD，Dex-70，蓝色），可以观察到脑血管；表面动脉（箭头）和静脉（箭头）是从形态学上定义的。与年轻的大脑相比（C），脑脊液示踪剂沿表面和穿透动脉以及进入周围间质的运动在中年大脑中明显减慢（D）.
图3
图3。衰老大脑贯穿动脉的血管搏动受到抑制
动脉内注射得克萨斯红结合右旋糖酐（MW 70kD，dex-70）后，通过薄型颅骨窗，通过活体双光子显微镜评估血管壁的搏动性。（A）通过颅窗可见的脑血管树的3D重建显示了穿透动脉（红色）、上行静脉（蓝色）和介入毛细血管床（灰色）。（B）在皮层表面下方z=0至150µm之间，在表面和穿透动脉、表面和上行静脉生成高频正交线扫描。（C）对具有代表性的原始x-t扫描进行阈值化，以提高边缘检测，并随时间测量管腔直径。（D-E）通过穿透动脉和上行静脉测量血管搏动。在年轻的大脑中，动脉搏动性明显大于静脉搏动性（*P<0.05，双向方差分析；每组4只动物的n=8-20条血管）。在老年大脑中，与年轻大脑相比，穿透动脉中的动脉搏动性显著降低（*P<0.05，年轻与老年）。未观察到静脉搏动的年龄相关差异。
图4
图4。间质体积不随年龄变化
（A）用体内TMA微电泳法测定细胞外体积分数（α）和扭曲度（λ）。TMA由离子电渗电极引入，并由第二个记录电极检测。细胞外体积分数或细胞外空间扭曲度的变化反映在所测TMA浓度的动力学中（详见（18））。（B）在清醒或麻醉小鼠的皮层中，幼年和老年动物的细胞外体积分数没有显著差异。年轻人和老年人的大脑在麻醉状态下均表现出明显且可比较的细胞外间隙增大（***P<0.001，清醒与麻醉；双向方差分析；每组9–20）。（C）幼年和老年动物的细胞外曲折度没有显著差异。
图5
图5。衰老的大脑中穿透动脉周围的血管周围AQP4极化消失
免疫荧光双标记法检测AQP4定位、GFAP表达和血管旁脑脊液再循环的变化。（A-B）脑干内注射荧光脑脊液示踪剂卵清蛋白结合的ALEXA-647（分子量45kD，OA-45）30分钟后固定的大脑切片通过共焦显微镜成像，显示与年轻皮层相比（A），AQP4在老年大脑中的定位变得更加分散，而GFAP表达增加，CSF示踪剂渗透减慢（B）在穿过脑小动脉（箭头、，C、 F类)或从脑毛细血管向外（箭头，D、 G公司).（C-D、F-G）与年轻大脑相比，衰老大脑血管周围的GFAP表达增加（***P<0.001，年轻与老年；重复测量双向方差分析；每组4只动物的11–18条血管）。穿透小动脉周围AQP4表达的变化较大（C）比皮质毛细血管（B）穿透血管周围组织中AQP4显著上调。血管周围AQP4的测量（E）和GFAP（H）表达表明，AQP4在穿透小动脉周围的血管周围区域下调，但在毛细血管周围不下调（*P<0.05；未配对t检验，每组4只动物的11–18条血管），而血管周围GFAP在两种血管类型周围的表达同样上调（***P<0.001；未配对t-检验）。
图6
图6。血管周围AQP4极化受损在衰老大脑的外侧和腹侧皮层、海马和纹状体中最大
用免疫荧光法检测年轻（2–3个月）和老年（18个月）大脑固定脑片中AQP4的表达、极化和GFAP的表达。评估前部不同区域的表达和极化（A-C）和后部（D-F）大脑切片。区域热图显示了年轻和老年大脑之间AQP4表达（AQP4-免疫荧光）、AQP4-极化（%面积）和GFAP表达（%区域）的平均变化。(A、 D类)在前部和后部区域，年轻和老年大脑的整体AQP4免疫荧光没有差异。（B、E）老年人脑血管周围AQP4极化显著降低，最显著的影响是侧皮层、腹皮层、纹状体和海马（*P<0.05，**P<0.01，***<0.001，青年vs.老年；双向方差分析；每组4例）。（C、F）与年轻大脑相比，老年大脑中GFAP的表达显著增加，在侧皮层、腹皮层、海马和纹状体中效果最明显（*P<0.05，**P<0.01，***<0.001，young vs.old；双向方差分析；每组n=4）。
图7
图7。在老年大脑中，腹侧皮层对glymphatic通路活性的抑制最为严重
在脑干内注射小分子量脑脊液示踪剂德克萨斯红结合右旋糖酐（MW 3kD，Dex-3）和大分子量卵清蛋白结合ALEXA 647（MW 45kD，OA-45）30min后，评估血管旁脑脊液再循环的年龄相关损害。年轻人的典型矢状和冠状切片（A）和旧的（B）与年轻大脑相比，整个老年大脑的脑脊液示踪剂穿透率显著降低。评估脑脊液示踪剂在特定脑区内的穿透情况，并从前部绘制热图（C）和后部（D）切片描述了在老年和年轻大脑之间的每个区域中观察到的平均OA-45 CSF示踪剂穿透的变化。OA-45在不同区域的穿透定量显示，血管旁脑脊液再循环在前后脑片的外侧和腹侧皮层均显著受损（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Young vs.Old；双向方差分析；每组4例）。
图8
图8。皮质血管周围AQP4极化缺失与血管旁脑脊液再循环受损相关
（A）在大脑皮层评估AQP4表达、AQP4-极化或GFAP表达与血管旁脑脊液示踪剂之间的关系。线性回归分析表明，GFAP和AQP4的表达水平与年轻或老年皮层血管旁脑脊液示踪剂渗透性的差异无关。在年轻和老年大脑皮层中，血管周围AQP4极化降低与血管旁脑脊液再循环受损显著相关（年轻大脑：*P<0.05，r2= 0.2149; 老年大脑：*P<0.05，r2= 0.2485).
图9
图9。软脑膜表面AQP4表达增加与经软脑膜脑脊液渗透受损相关
在年轻人的大脑外侧皮层中，评估了膜下AQP4和GFAP表达的变化与经皮脑脊液示踪剂渗透之间的关系（A）和旧的（B）老鼠。（C）在从软脑膜表面向内延伸的线性感兴趣区域（白色虚线）评估AQP4和GFAP表达和CSF示踪强度。（D）与年轻大脑相比，老化大脑中软脑膜表面附近的AQP4表达显著增加（**P<0.01，年轻与老年；双向重复测量方差分析，每组6–8个），而GFAP免疫反应性没有显著改变。老化大脑中软脑膜下AQP4表达增加与经皮脑脊液示踪剂穿透显著降低相关（**P<0.01，年轻与老年；双向重复测量方差分析，每组6–8）。
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