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.2014年11月；88(22):13029-46.
doi:10.1128/JVI.01430-14。 Epub 2014年8月27日。

需要通过酸性pH值和高K+浓度逐步启动，以便在穿透后有效揭开甲型流感病毒核心的外壳

莎拉·斯陶弗 1, 岳汉峰 2, 菲拉特·内比奥卢 2, 罗莎莉·海利格 2, 保拉·皮科蒂 2, 阿里·海伦纽斯 1
附属公司

需要通过酸性pH值和高K+浓度逐步启动，以便在穿透后有效揭开甲型流感病毒核心的外壳

莎拉·斯陶弗等。 J维罗尔. 2014年11月.

摘要

甲型流感病毒（IAV）利用晚期内吞液泡中的低pH值作为膜融合穿透的线索。在这里，我们分析了预融合反应，这些预融合反应使核心在被输送到细胞溶质后为脱包衣做准备。我们发现，这种启动过程分两步进行，这两步由包埋的M2离子通道介导。第一种减弱了基质蛋白M1和病毒核糖核蛋白束之间的相互作用。在pH值低于6.5时，M1的连接序列和C末端结构域发生构象变化。第二步由pH值<6.0和K（+）离子流入触发。它会引起M1的额外变化以及病毒核糖核蛋白束的稳定性丧失。我们的结果表明，成熟内体中从Na（+）到K（+）的转换和pH的降低都是启动IAV核心以有效地揭开外壳和感染宿主细胞所必需的。

重要性：IAV的进入涉及几个步骤，包括内吞和晚期内体融合。进入还包括病毒核心的分解，该核心由病毒核糖核蛋白和RNA基因组组成。我们发现IAV的脱膜过程早在核心进入胞浆之前就开始了。M2是病毒膜上的一个离子通道，当病毒通过早期内体时被激活。这里，我们表明质子通过M2进入病毒会导致基质蛋白M1的构象变化。这削弱了M1和病毒核糖核蛋白之间的相互作用。当病毒进入晚期内体时，发现发生了第二种变化。然后将预酸化的核心暴露于高浓度的K（+），这会影响核糖核蛋白之间的相互作用。因此，当核心最终被输送到细胞溶质中时，它们已经部分失稳，因此，脱包了活性和传染性。

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数字

图1
图1
酸性诱导IAV在A549细胞PM处融合。（A） 酸-旁路感染检测的示意图概述。病毒在冰上与A549细胞结合，然后在37°C下进行2分钟pH 5.0脉冲。在37°C的感染培养基中，将酸-旁路对照样品培养2分钟。酸旁路后，将细胞在37°C的停止培养基中培养14小时，以阻止内体酸化，从而阻止病毒通过内吞作用进一步进入。（B） A549细胞PM处X31融合的薄片电镜观察。病毒与冰上的细胞结合，直接固定（左侧）或在37°C（中部和右侧）的融合培养基（pH 5.0）中培养60至90 s，然后固定。融合过程中可以捕获具有紧凑核心元素（红色星号）的病毒。病毒糖蛋白在PM（黑色箭头）的外侧清晰可见。条形，100 nm。（C） 荧光光谱监测酸暴露后R18-标记X31与A549细胞表面的融合动力学。将标记的病毒与冰上的细胞结合后，将样品转移到37°C，然后通过将pH值降低到指示值来启动融合。随着时间的推移，测量R18的荧光去猝灭，并通过添加0.1%（最终浓度）的Triton X-100终止反应，从而释放出最大的去猝灭能力。显示的R18去猝灭百分比归一化为0.1%Triton X-100存在下测得的荧光。最大值，最大值。（D） 通过内吞作用比较RNA病毒的酸通道感染和正常感染。按照A组图例所述进行酸-旁路方案。在正常感染的情况下，病毒与A549细胞结合，清洗，并在感染培养基中持续培养，直至固定。IAV和UUKV通过免疫染色进行评分，检测新合成的病毒核蛋白。在GFP表达的基础上检测SFV和VSV感染。感染细胞的百分比被归一化为正常感染的数值。（E） 酸-旁路感染前预处理示意图（上图）。将X31在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，并将其调节至指定的pH值。在冰上结合1小时后，执行面板A图例中所述的正常酸旁路协议（红线，初级年轴）。体外在单独的实验中测试HA酸化和融合能力的pH值（蓝线；二级年轴）。使用仅针对酸性HA（蓝线，开圈）的构象特异性抗体（A1）评估HA酸化。通过应用基于FACS的融合分析（蓝线，闭合圈）确定融合能力。（F） 酸-旁路感染前的预处理动力学。病毒在DMEM缓冲液中预处理指定的潜伏期，并在37°C下调整到指定的pH值，然后进行酸-旁路感染，如面板E的图例所述。（G）酸-旁路传染前WSN（wt）的预酸化。WSN（wt）在37°C下用指定的基于DMEM的pH缓冲液预处理10分钟，然后按照X31所述执行酸旁路和感染评分方案。
图2
图2
弱酸预处理对IAV感染、病毒结合和融合的影响。（A） 在酸-旁路感染之前对X31进行预酸化和中和。将病毒在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，缓冲液调节至指定的pH值。如顶部示意图所示，一半样品通过添加HEPES（1 M，pH 9.5）（白色条）进行中和。两组样品均进行了酸-旁路感染试验。（B） X31在正常感染前的预处理。如顶部示意图所示，病毒在基于DMEM的缓冲液中预处理1小时，并在37°C下调整到相应的pH值，中和，然后添加到A549细胞中。细胞在感染培养基中培养并固定在10 h p.i。统计显著性由Student’st吨测试。（C） 预酸化病毒与A549细胞的结合。X31用指定的基于DMEM的pH缓冲液在37°C下预处理1小时，在冰上结合1小时，并固定。在PBS中对细胞进行大量清洗，使其不渗透。用多克隆抗X31抗体通过间接免疫荧光检测结合颗粒。用WGA染色显示细胞边界，用DRAQ5染色细胞核。显示了所有条件下的典型共焦图像（右）和量化结果（左）。棒材，15μm。（D） 荧光光谱监测预酸化和中和后R18-标记X31与A549细胞表面的融合动力学。按照图1C图例中的说明测量R18去淬。季前。，预处理；中子。，中和；不另作说明，无显著差异。
图3
图3
在pH5.0介导的融合之前，病毒核心蛋白的轻度酸化会导致更有效的脱膜。（A） IAV在预酸化和酸诱导的PM融合后脱膜。病毒在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，缓冲液pH调节为7.4和5.8。中和后的病毒与冰上的A549细胞结合，并按照酸-旁路感染试验所述诱导融合。融合后，在含有CHX的终止培养基中培养细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），固定细胞，并通过间接免疫荧光分别对M1和NP进行染色。（右）代表性图像。DRAQ5染色显示细胞核。（左）M1和NP暴露，作为病毒脱膜的测量，通过测量每个细胞的总荧光来确定，并用ImageJ进行量化。棒材，20μm。（B） 预酸化病毒酸旁路时M1和NP的检测。如面板A图例所述，病毒在A549细胞的PM处进行预处理和融合。在含有CHX的终止培养基中培养5分钟后，固定细胞并对其进行M1和NP染色。白色箭头，无M1 NP-染色。棒材，10μm。（C） 在100μM M2抑制剂金刚烷胺存在下，WSN（wt）和金刚烷烷胺敏感WSN（AS）的酸旁路感染。有关构建重组WSN（AS）的详细信息，请参见材料和方法。（D） 在金刚烷胺存在下对WSN（wt）和WSN（AS）进行预酸化。病毒在RT下用金刚烷胺预处理5分钟，然后在37°C下在pH 6.2下预酸化10分钟。在与X31相同的条件下进行酸旁路感染。（E） 存在CCCP时X31的酸旁路。如右图所示，IAV要么未经处理（条件1），要么在37°C（条件2）下在pH 5.8下预酸化1小时，要么在RT（条件3）下用CCCP处理5分钟，或者预酸化与CCCP处理相结合（条件4）。样本接受了A549细胞的酸-旁路感染试验或正常感染，如面板A的图例所述。CCCP在2分钟融合步骤中进一步出现，但不包括在随后的停止和感染培养基中培养。（F） 在存在CCCP的情况下，在PM处酸诱导熔融后，IAV脱涂层。如图1D图例所示，使用CCCP和酸旁路进行预培养。酸旁路后固定细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），并进行间接免疫荧光。图中显示了具有代表性的DRAQ5核染色图像（左）和量化图像（右）。按照面板A的图例中所述对样品进行分析。棒材，20μm。（G） 在存在CCCP和金刚烷胺的情况下对WSN（AS）进行酸旁路。如左图所示，IAV要么未经治疗（条件1），要么在RT时用金刚烷胺（条件2）或CCCP（条件3）预处理5分钟。当两种药物联合使用时（条件4），首先用金刚烷胺处理病毒5分钟以阻断M2通道，然后将CCCP添加到溶液中，并将混合物进一步孵育5分钟。在融合步骤中存在药物，但不包括随后在停止培养基中孵育的药物。在与X31相同的条件下进行酸-旁路感染试验。
图4
图4
高K的影响+IAV堆芯启动期间的浓度。（A） 在酸-旁路感染之前，在各种单价阳离子条件下进行预酸化。将X31在37°C的缓冲液中预处理1 h，缓冲液的pH值调整为7.4或5.8，并补充120 mM指示的单价阳离子。总离子强度保持不变。结合后，采用文中所述的正常酸-旁路方案。（B） K预孵育+浓度范围（0至135 mM K+)酸碱性感染前pH值为5.8。（C） 预处理病毒与A549细胞的结合。在所示条件下，将X31在37°C下预处理1 h，中和，并在冰上与A549细胞结合1 h。细胞被固定、清洗并保持不渗透状态。使用抗X31多克隆抗体（Pinda）检测结合颗粒。（D） 暴露于高（120 mM）和低（5 mM）K的酸性条件下，HA酸化+浓度在37°C下保持1小时。（E） 在120 mM K存在下预酸化（pH 5.8）后R18-标记X31与A549细胞表面融合动力学的荧光光谱监测+按照图1C图例中的说明测量R18去淬。（F） 在120 mM K存在下预酸化后IAV脱涂层+并在PM处进行酸诱导融合。病毒在37°C下预处理1h。中和后的病毒与冰上的A549细胞结合，并按照酸-旁路感染试验所述诱导融合。融合后，在含有CHX的终止培养基中培养细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），固定细胞，并通过间接免疫荧光分别对M1和NP进行染色。（左）代表性图像。DRAQ5染色显示细胞核。（右）M1和NP暴露，作为病毒脱壳的测量，如图3A图例所述进行量化。棒材，20μm。（G） 存在和不存在K时X31的预酸化（预酸）+-120 mM和5 mM K下的特异性离子载体缬霉素+在酸-旁路感染之前。（H） 在CCCP、缬氨霉素和金刚烷胺存在下对WSN（AS）进行酸旁路感染检测。（右）如图所示，IAV在RT时用指示的药物组合预处理5分钟。当金刚烷胺与CCCP、缬氨霉素或两者结合时，病毒首先用金刚烷碱处理5分钟以阻断M2通道，然后用CCCP、valinomycin、，或者将两者都添加到溶液中，并将混合物进一步培养5分钟。在融合步骤中存在药物。在与X31相同的条件下进行酸-旁路感染试验。
图5
图5
启动引发IAV堆芯的逐步拆卸在体外.（A）体外X31在不同pH条件下脱膜。将纯化的X31稀释在1 ml MNT（20 mM MES，100 mM NaCl，30 mM Tris）缓冲液中，缓冲液分层在两步甘油梯度上：3 ml 15%（vol/vol）甘油，在蒸馏水中制备，不添加任何添加剂（夹层），3.4 ml 25%甘油（vol/vol），含1%NP-40（底层）。将底层调节至所需的pH值和盐浓度。对于中性pH值，完整的亚病毒颗粒被制成颗粒，而有利于病毒脱外壳的条件导致病毒核心成分分解到底层。去除甘油上清液，将小球溶解在非还原性样品缓冲液中，然后进行SDS-PAGE。凝胶用考马斯染色，病毒蛋白带强度用密度计定量。在恒定的盐浓度（150mM NaCl）下测试指示的pH条件。作为对照，从底部甘油层中省略NP-40。用IAV PB2单克隆抗体通过Western blot分析检测vRNP。（B） 面板A中显示的病毒蛋白带强度的密度定量。蛋白带强度标准化为pH 7.4，不含NP-40。（C）体外在弱酸性pH值（pH 5.5）下脱开WSN（wt）涂层。将图例中描述的相同实验设置应用于面板A。（D） 高K的影响+X31脱涂层的浓度（135 mM）和pH值5.8在体外按照面板A的图例进行分析。（E）面板D中显示的病毒蛋白带强度的密度定量。蛋白带强度标准化为pH 7.4，不含NP-40。（F） K范围的影响分析+浓度（0至135 mM K+)pH 5.8，X31脱涂层在体外。按照面板A图例所述进行分析。通过向底部甘油层补充所示量的NaCl和KCl来保持总离子强度恒定。（G） 面板F中显示的病毒蛋白带强度的密度定量。蛋白质带强度标准化为pH 7.4和135 mM Na条件下的强度+和NP-40。
图6
图6
LiP探测启动后病毒衍生IAV核心蛋白的结构转变。（A） 基于胰蛋白酶（Tryp.）的轻度酸化X31病毒的LiP。X31在pH 7.4和5.8下在37°C下预处理1小时，中和，并用0.1%Triton X-100（Tx-100；室温下20分钟）裂解。对照样品未经分析。以1:4（胰蛋白酶/M1）的比例添加胰蛋白酶，并在RT下培养混合物指定的时间。通过添加含有2 mM PMSF的还原SDS样品缓冲液停止反应。样品通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对M1（HB-64）的单克隆抗体通过Western blot分析进行M1胰蛋白酶裂解。（B） 适用于X31的LiP-SRM工作流程示意图。用0.1%NP-40中和和溶解引物和未引物病毒样品（RT下20分钟）。在酶/底物比为1:100的情况下，用PK进行5分钟的LiP。随后对样品进行变性和胰蛋白酶化，以进行LC-SRM/MS分析。比较了预处理和未预处理样品的胰蛋白酶肽强度。（C） 预酸化病毒（pH 5.8，60 min，37°C）和对照病毒（pH 7.4）之间M1、NP和HA的定量LiP肽的倍数变化反映了PK裂解敏感性的差异。x个轴，原木2（褶皱变化）；年轴，−log10(P（P）值）。P（P）每个条件下通过三次技术复制获得数值。使用P（P）<0.01的值被认为是显著的。（D，E）将LiP肽映射到M1序列（D，底部），并对M1（D，顶部）和NP（E）中的PK裂解位点进行图解可视化。三角形表示观察到预酸化病毒PK裂解显著增加的位置（基于LiP分析）。（F） 在5 mM K中预酸化的病毒之间，M1、NP和HA定量肽的倍数变化反映了PK裂解敏感性的差异+（低K+浓度）和病毒在120 mM K中预酸化+（高K+浓度）。调整了面板A的相同设置。（G） （底部）肽到M1序列的映射。（顶部）三角形表示在用120 mM K处理的病毒中观察到PK裂解增加的位置（基于LiP分析）+pH值5.8。（D、E和G）显示了病毒蛋白M1和NP的结构域组织示意图。指出了其他病毒成分的结合位点。NLS，核定位信号。
图7
图7
K荧光增强+-LEs中的敏感染料APG3。（A） 用APG3装载内体。A549细胞在EGF-AF647（200 ng/ml）在冰上结合30分钟之前，血清饥饿4小时。然后用生长培养基清洗细胞，并在37°C下用APG3加载30分钟（APG3脉冲）。活细胞用共焦显微镜成像。EGF-AF647信号被假彩色为红色，以便更好地显示产生的黄色共定位信号。（B） 随时间内化后APG3荧光。如图A图例所述，用APG3加载细胞。用染料孵育30分钟后，洗涤细胞，转移到显微镜下，并在指定的时间点成像。在诺卡唑治疗的情况下，细胞在药物和APG3存在下孵育30分钟，然后与新鲜的诺卡唑培养基交换成像时间。（上图）APG3脉冲后60分钟两种情况的代表性图像；使用基于ImageJ的定量测定APG3加载后指定时间点的（底部）平均荧光强度。（A，B）细胞边界和细胞核在传输模式下确定，并在图像中以虚线表示。棒材，20μm。
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