Origin of myofibroblasts in the fibrotic liver in mice

doi:10.1073/pnas.1400062111

。2014年8月12日；111（32）：E3297-305。

doi:10.1073/pnas.1400062111。 Epub 2014年7月29日。

小鼠肝纤维化中肌成纤维细胞的来源

附属公司

¹日本京都大学医学研究生院肿瘤靶向治疗医学系，京都606-8507；手术，和。
²首都医科大学北京友谊医院内科、外科，北京100050；
^三医学部。
⁴加利福尼亚大学药学院，圣地亚哥，拉霍拉，加利福尼亚州92093；
⁵内科、外科和。
⁶韩国首尔成均馆大学医学院三星医学中心内科消化科和肝病科，135-710；
⁷山东大学齐鲁医院肝内科，山东250012；
⁸日本京都大学医学研究生院免疫调节与治疗创新中心，京都606-8507；
⁹MedImmune有限公司，英国剑桥CB21 6GH；以及。
¹⁰日本日本大学人文与科学学院化学系，日本东京Setagaya Sakurajousui，156-8550。
¹¹细胞和分子医学，以及。
¹²外科手术，以及tkisseleva@ucsd.edu。

PMID： 25074909
预防性维修识别码：项目经理4136601
内政部： 10.1073/第140006211页

小鼠肝纤维化中肌成纤维细胞的来源

岩崎敬子等人。美国国家科学院程序。 2014。

。2014年8月12日；111（32）：E3297-305。

doi:10.1073/pnas.1400062111。 Epub 2014年7月29日。

附属公司

¹日本京都大学医学研究生院肿瘤靶向治疗医学系，京都606-8507；手术，和。
²首都医科大学医学、外科和北京友谊医院，北京100050；
^三医学部。
⁴加利福尼亚大学药学院，圣地亚哥，拉霍拉，加利福尼亚州92093；
⁵内科、外科和。
⁶韩国首尔成均馆大学医学院三星医学中心内科消化科和肝病科，135-710；
⁷山东大学齐鲁医院肝内科，山东250012；
⁸日本京都大学医学研究生院免疫调节与治疗创新中心，京都606-8507；
⁹MedImmune有限公司，英国剑桥CB21 6GH；和。
¹⁰日本日本大学人文与科学学院化学系，日本东京Setagaya Sakurajousui，156-8550。
¹¹细胞和分子医学，以及。
¹²外科手术，以及tkisseleva@ucsd.edu。

PMID： 25074909
预防性维修识别码：项目经理4136601
内政部： 10.1073/第140006211页

摘要

肝肌成纤维细胞被激活以应对任何病因的慢性肝损伤，从而产生纤维瘢痕。尽管进行了广泛的研究，但肌成纤维细胞在不同类型的纤维化肝病中的起源尚未解决。为了确定不同的肌成纤维细胞群体并量化它们对两种不同病因的肝纤维化的贡献，胶原蛋白-α1（I）-GFP小鼠受到肝毒性（四氯化碳；CCl4）或胆汁淤积（胆管结扎；BDL）肝损伤。所有肌成纤维细胞通过GFP（+）细胞流式细胞术纯化，然后通过表型鉴定不同亚群。在这些小鼠肝纤维化模型中，肝常驻活化肝星状细胞（aHSC）和活化门静脉成纤维细胞（aPFs）是纤维原性肌成纤维细胞的主要来源（>95%）。正如之前使用其他方法报道的那样，肝星状细胞（HSC）是CCl4肝损伤中肌成纤维细胞（>87%）的主要来源。然而，在胆汁淤积性肝损伤中，aPFs是肌成纤维细胞的主要来源，在损伤开始时（5天BDL），其贡献率超过70%。aPFs的相对贡献随着进行性损伤而降低，因为HSC被激活并对肌成纤维细胞群有贡献（14天和20天BDL）。与aHSC不同，aPF对牛磺胆酸和IL-25的刺激分别通过诱导胶原蛋白-α1（I）和IL-13作出反应。此外，BDL激活的PFs表达高水平的I型胶原，并向HSC提供刺激信号。基因表达分析确定了几种新的aPFs标记物，包括间皮特异性标记物间皮素。PFs可能在淤胆性肝纤维化的发病机制中发挥关键作用，因此，它是抗纤维化治疗的一个有吸引力的靶点。

关键词：ECM沉积；纤维原性肌成纤维细胞标志物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
BDL和CCl对Col-GFP小鼠肝纤维化的影响₄. (A类)CCl公司₄-治疗组和BDL操作组小鼠（但非假小鼠，8周龄，n个=10/组）出现肝纤维化，如天狼星红染色、胶原蛋白-GFP荧光显微镜和α-SMA染色所示（20×目标）。(B类)通过羟脯氨酸和天狼星红（阳性区域）含量以及各组小鼠中纤维生成基因（Col和α-SMA）的mRNA水平评估纤维化**P（P）*< 0.003; ***P（P）*< 0.001.

**图2。**
肝肌成纤维细胞的检测、定量和分离。(A类)流式细胞术分析肌成纤维细胞的策略：通过GFP表达在非实质组分中鉴定出表达I型胶原的肌成纤维纤维细胞，并进一步分离为Vit。A类⁺和维生素。A类^负极细胞。(B类)未经处理的BDL-和CCl非实质部分的FACS分析₄-治疗Col-GFP小鼠：GFP⁺用488nm波长的氩激光和Vit检测细胞。A类⁺在405nm波长下用紫激光检测细胞。显示了代表性的点图，*P（P）*< 0.03. GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类^负极对细胞进行分类纯化，并通过光学显微镜和荧光显微镜分析GFP和维生素A的表达（紫外线激光，20倍物镜）。(C类)基于流式细胞术的GFP定量⁺肌成纤维细胞。维生素A在GFP中的表达⁺分析不同时间点Col-GFP小鼠非实质部分的细胞(n个=每个时间点6个）₄和BDL，*P（P）*< 0.01. (D类)GFP的免疫表型⁺从BDL小鼠分离的肌成纤维细胞。GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类^负极从Col-GFP小鼠中分离纯化出的组分(n个=6）BDL后（20 d）。使用特异性抗体或同型匹配对照（40×目标）通过免疫细胞化学分析肌成纤维细胞标记物（α-SMA）、HSC标记物（结蛋白、GFAP、CD146）和PF标记物（弹性蛋白、Thy1）的表达。GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类^负极细胞分别被鉴定为aHSC和aPFs。对于每个部分，计算阳性染色细胞的百分比（与总细胞相比，100%，*P（P）*< 0.05). (E类)GFP的定量⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类^负极分数基于GFP中HSC和PF特异标记的表达⁺免疫细胞化学检测肌成纤维细胞（100%），*P（P）*< 0.05.

**图3。**
aPF和aHSC的特征。(A类)BDL（20天）GFP⁺维生素。A类^负极aPFs和GFP⁺维生素。A类⁺用小鼠全基因组微阵列分析aHSC，并将其基因表达谱与CCI中的基因表达谱进行比较₄-活化GFP⁺维生素。A类⁺HSC。与其他组相比，细胞组富集基因的文氏图显示出两倍以上的上调。(B类)GO-TERM：显示BDL-aPFs与BDL-或CCl中上调或下调的信号通路₄-aHSC。(C类)qHSCs、BDL-aHSCs和BDL-aPFs以及CCl中所选基因的表达₄-aHSC。结果是Agilant微阵列获得的相对mRNA水平（标准化值/多探针/每个基因的平均值），*P（P）*< 0.001. (D类)通过RT-PCR分析从同一小鼠分离的BDL-（5 d）aPFs和BDL-aHSC中纤维生成基因的表达(n个=6），并与qHSCs-aHSCs和CCl中的值进行比较₄（1.5个月）-aHSC。数据显示为与qHSC相比的折叠诱导***P（P）*BDL-aPF和BDL-aHSC显示<0.02；ns不显著。(E类)分析BDL（17 d）-aPFs和BDL-aHSC（从同一小鼠分离，n个=6）通过RT-PCR对比qHSC。数据显示为与qHSC相比的折叠诱导**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01; ns，无显著性。(F类)同样，CCl₄-（1.5个月）aPFs和CCl₄-aHSC，从同一小鼠中分离(n个=4）通过RT-PCR分析。数据显示为qHSC上的折叠感应**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01. 中的数据D类–F类代表至少三个独立的实验。

**图4。**
aPF和aHSC的功能特性。(A类)比较BDL-aPFs和CCl对细胞因子的反应₄-aHSC。aHSC和aPFs对TGF-β1（10 ng/mL）都有反应。aHSC而非aPFs对PDGF（100 pg/mL）和NGF（100 ng/mL）有反应。数据是与未经治疗的aPF（或aHSC）相比的折叠诱导，*P（P）*< 0.01. (B类)BDL-aPFs（但不是BDL-aHSC或CCl₄-aHSC）对胆汁酸牛磺胆酸（TCA；1200 nmol/mL）的反应是上调*第1a1列*和IL-13分泌产生的IL-25（100 ng/mL），*P（P）*< 0.05. 用牛磺脱氧胆酸盐（TUDCA；25 nmol/mL）、去氧胆酸（DCA；0.1 nmol/mL）、牛磺酚脱氧胆汁酸盐（TCDCA；60 nmol/m L）、牛磺酸β-丝氨酸（TbMCA；2000 nmol/mL.L）和胆酸（CA；20 nmol/mL.L）刺激aPFs未导致Col1a1诱导。数据是与未经治疗的aPF（或aHSC）相比的折叠诱导**P（P）*< 0.05. (C类)评估IL-13对HSC激活的影响。qHSC与IL-13（100 ng/mL）孵育4 h和24 h。通过RT-PCR评估基因表达**P（P）*< 0.01; ***P（P）*< 0.02; ns，无显著性。数据(A类–C类)代表三个独立的实验。在每次实验中，从三只小鼠身上分离细胞。(D类)小鼠HSC中的IL-13信号：如RT-PCR所示，IL-13刺激的HSC（100 ng/mL，6 h）上调IL-13Rα2、tenascin C和eotaxin，但不表达IL-13或IL-6。(E类)HSC中的IL-13信号传导（2小时）引起ERK1/2（被ERK抑制剂U0126，10μM阻断）、p38和Smad1/5的磷酸化，如蛋白质印迹所示。TGF-β1刺激的HSC作为对照。

**图5。**
aPFs中间皮素的表达与小鼠淤胆性肝纤维化相关。(A类)通过RT-PCR比较aPFs和肝脏其他细胞中选定特征基因的表达。*间皮素、阿司匹林、碱性核素1、降钙素-*α,和*尿路蛋白1*βmRNA在BDL-（17d）aPFs中上调，但在KC、内皮细胞（EC）、BDL-和CCl中不上调₄-aHSC和qHSC，或BDL诱导的胆管细胞（Ch）。通过KC中F4/80、EC中CD31、Lrat、GFAP和HSC中Desmin、aPFs中Thy1和胆管细胞中K19的表达来评估每个组分的纯度。数据（来自三个独立实验）显示为相对mRNA表达，*P（P）*< 0.01. (B类)从BDL（17天）损伤的Col-GFP小鼠中分离出aPFs和aHSC，并用抗间皮素抗体染色。间皮素仅在aPFs中表达（而在GFAP中未表达⁺aHSC）并与Elastin（TE-7）和Thy1染色共定位。计算免疫染色细胞的百分比，*P（P）*<0.05（四个独立实验；图S7B类). (C类)BDL-（17天）或CCl肝组织石蜡切片₄-（1.5个月）给药小鼠(n个=每组4人）用抗间皮素抗体或同型对照进行免疫染色。在BDL小鼠中检测到间皮素的表达，但在假手术小鼠中未检测到。CCl中仅检测到少量间皮素阳性细胞₄-治疗小鼠。使用20倍和40倍物镜显示代表性图像(图S7C类). (D类)激光捕获显微切割检测到BDL诱导的间皮素上调（但不包括CCl₄-诱导）肝纤维化。采用激光捕获显微切割技术从BDL（20 d）小鼠和CCl小鼠分离门脉周围肌成纤维细胞₄（1.5个月）给药小鼠(n个=3/组），通过RT-PCR分析细胞aPF-和aHSC-特异性标记物的表达。间皮素、弹性蛋白和Thy1在从BDL肝门脉周围区域获得的肌成纤维细胞中高度表达。结蛋白在CCl中高水平表达₄-治疗过的肝脏。与结蛋白不同，间皮素在CCl中不表达₄-治疗的门脉周围区域。数据（来自三个独立实验）是与假小鼠门脉周围区域相比的mRNA折叠诱导**P（P）*< 0.01; ***P（P）*< 0.05; ns，无显著性。

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[9] Scholten D等。纤维原性肝损伤中纤维细胞的迁移。《美国病理学杂志》。2011;179(1):189–198.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Scholten D等。纤维原性肝损伤中纤维细胞的迁移。《美国病理学杂志》。2011;179(1):189–198.-项目管理咨询公司-公共医学

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