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.2014年6月19日；157(7):1685-97.

doi:10.1016/j.cell.2014.04.038。

Hsp90和Hsp70伴侣周期协同作用调节糖皮质激素受体功能

伊莱恩·柯斯克¹, 德夫里希·戈斯瓦米², 丹尼尔·索斯沃思¹, 帕特里克·R·格里芬², 大卫·A·阿加德^三

附属公司

附属公司

¹美国加州大学旧金山分校霍华德·休斯医学院，邮编：94158；美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学生物化学和生物物理系94158。
²美国佛罗里达州朱庇特市斯克里普斯研究所分子治疗学系，邮编：33458。
^三美国加州大学旧金山分校霍华德·休斯医学院，邮编：94158；加利福尼亚大学生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山市，加利福尼亚州94158，美国。电子地址：agard@msg.ucsf.edu。

PMID： 24949977
预防性维修识别码：项目经理4087167
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2014.04.038

Hsp90和Hsp70伴侣周期协同作用调节糖皮质激素受体功能

伊莱恩·柯斯克等。单元格. 2014.

.2014年6月19日；157(7):1685-97.

doi:10.1016/j.cell.2014.04.038。

作者

伊莱恩·基尔施克¹, 德夫里希·戈斯瓦米², 丹尼尔·索斯沃思¹, 帕特里克·R·格里芬², 大卫·A·阿加德^三

附属公司

¹美国加州大学旧金山分校霍华德·休斯医学院，邮编：94158；加利福尼亚大学生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山市，加利福尼亚州94158，美国。
²美国佛罗里达州朱庇特市斯克里普斯研究所分子治疗系，邮编33458。
^三美国加州大学旧金山分校霍华德·休斯医学院，邮编：94158；加利福尼亚大学生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山市，加利福尼亚州94158，美国。电子地址：agard@msg.ucsf.edu。

PMID： 24949977
预防性维修识别码：项目经理4087167
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2014.04.038

摘要

糖皮质激素受体（GR）与许多信号蛋白一样，在体内功能依赖于Hsp90分子伴侣。虽然体内配体结合需要Hsp90，但纯化的载脂蛋白GR能够结合配体，而Hsp90没有增强作用。我们发现，已知Hsp70可以促进客户传递到Hsp90，它通过部分去折叠使GR失活，而Hsp90可以逆转这种失活。配体结合的完全恢复需要在Hsp90和Hop和p23共纸酮上进行ATP水解。令人惊讶的是，Hsp90 ATP水解似乎通过两个伴侣的ATP循环的耦合来调节来自Hsp70的客户转移。这种耦合体现在低温电子显微镜成像的GR:Hsp70:Hsp90:Hop复合体中Hsp90和Hsp70之间的接触中。虽然从Hsp70释放的GR易于聚集，但从Hsp90释放可以保护GR免受聚集并增强其配体亲和力。总之，这说明了协同伴侣相互作用如何增强稳定性、功能和调节。

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数字

图1。GR配体结合活性体外试验Hsp90是否独立
A）通过荧光偏振测量20nM F-dex与GRLBD的平衡结合（±SD）。绑定曲线拟合K_天154±14nM（±SEM）。B）与5mM ATP/MgCl的平衡结合₂单独使用GRLBD（蓝色）和5µM Hsp90（红色）（±SD）。

图2。Hsp70抑制GR配体结合
A） F-dex与GRLBD（蓝色）、Hsp40（黄色）、Hps70和ATP（黑色）以及Hsp40、Hsp70和ATP的关联动力学（红色）。分析条件：5mM ATP/MgCl₂、50nM F-dex、1µM MBP-GRLBD、2µM Hsp40和15µM Hsp70。B） Hsp70的伴侣循环。ATP结合的NBD打开SBD，使底物结合较弱。底物和Hsp40刺激ATP水解，导致高亲和力底物结合状态，盖子被锁住。底物释放发生在ADP：核苷酸交换因子（NEF）促进的ATP交换。C） 1µM MBP-GRLBD与20nM F-dex（含2µM Hsp40）平衡结合的Hsp70浓度依赖性（±SD）。拟合合作竞争绑定模型会产生IC₅₀4.6±0.4µM，希尔系数1.6±0.4μM（±SEM）。D） 100nM F-dex与MBP-GRLBD（含2µM Hsp40）的解离是由过量（100µM）的未标记dex（蓝色）和15µM的Hsp70（红色）引发的，符合单指数衰减。插图显示平均关闭率；0.029±0.002分钟⁻¹和0.066±0.005分钟⁻¹使用Hsp70（±SEM）。另请参见图S1。

图3。氢交换质谱法检测Hsp70对GRLBD部分展开的影响
GRLBD和Hsp70结合的GRLBD之间的差异HDX映射到GRLBD（1M2Z）的dex和辅激活肽结合的晶体结构上。平均HDX的差异以百分比变化表示，并根据键进行着色，Hsp70使用橙色更快。括号内的数字是3个重复之间的标准偏差。图中显示了发生最显著构象变化的区域的相应氘积累曲线（±SD）。右上角显示放大dex，以及螺旋3形成的三个氢键。另请参见图S2。

图4。Hsp90系统从Hsp70抑制中恢复GR配体结合并增强配体结合
A）没有核苷酸，Hsp90处于扩展开放状态。在ATP稳定关闭状态下，NTD二聚化需要绕MD界面旋转NTD。HOP用旋转的NTD绑定中间开放状态，p23绑定闭合ATP绑定状态。B）图4的实验方案。C） 20nM F-dex与1µM MBP-GRLBD与不同伴侣成分的平衡结合（±SD）。检测条件；50µM 17AAG、2µM Hsp40和15µM Hsp70、Hsp90、HOP和p23。D）用2µM Hsp40将20nM F-dex与1µM MBP-GRLBD结合的饱和度图，以及15µM（M）Hsp70、HOP和p23，随着Hsp90 WT（红色）的增加，水解死亡的Hsp90；E47A（黑色）和D93N（蓝色）（±SD）。WT-Hsp90结合曲线符合半最大有效浓度方程。E） 20nM F-dex与300nM MBP-GRLBD单独（蓝色）以及2µM Hsp40、15µM Hsp70、Hsp90、HOP和p23（红色）的结合动力学符合单相结合。F） 100nM F-dex与1µM MBP-GRLBD（蓝色）和15µM Hsp70、2µM Hesp40和10µM Hsp90、HOP和p23（红色）结合的归一化解离动力学。关闭速度分别为0.041±0.004 min⁻¹和0.059±0.002分钟⁻¹（±SEM）（图S4D）。G）平均k_{光突发事件}与GRLBD（蓝色）和15µM Hsp70、2µM Hsp40和10µM H sp90、HOP和p23（红色）的3-5个单独实验中的GRLBD浓度的关系（±SEM）。根据线性拟合的斜率确定的速率为0.165±0.008和0.304±0.072µM⁻¹最小值⁻¹带伴侣（±斜率加权误差）（图S4C）。H） 20nM F-dex与GRLBD的归一化平衡结合（蓝色），以及与15µM Hsp70、2µM Hsp40和10µM H sp90、HOP和p23（红色）的归一性平衡结合（2个单独实验的平均值（±SD）。一）平均配体K_天有无伴侣的GRLBD由5个单独的实验测定（如图4H所示）。K（K）_天伴随伴侣从201±42nM降至66±12nM（±SEM）。另请参见图S3和S4。

图5。Hsp90、Hsp70、HOP、GRLBD复合物的冷冻电镜重建
A） Hsp90、Hsp70、HOP、GRLBD复合物的冷冻EM重建，过滤至38℃。B） A中的低温EM重建，Hsp70 NTD（3ATU）和SBD（1DKX）放置在青色中，Hsp90 NTD旋转HOP模型放置在洋红中（Southworth和Agard，2011）。客户绑定站点残留物大肠杆菌热休克蛋白90；E466、W467、N470显示为红色，M546、M550、L553、F554显示为蓝色（Genest等人，2013年）。C）俯视图显示Hsp70域（青色）之间链接器的密度。D）顶视图显示Hsp70 NTD在Hsp90 NTD之间的定位。另请参见图S5和S6。

图6。Hsp90的水解非依赖性伴侣功能对维持活性GR群体至关重要
A） Hsp70和Hsp40预抑制B.GRLBD的实验方案，并与F-dex平衡。配体结合由Bag-1或Hsp90系统启动。B）配体结合由Bag-1（黑色）、Hsp90与HOP和p23（红色）、Hsp90（E47A）与HOP和p23（绿色）、Bag-1加Hsp90与HOP和p23（紫色）以及Bag-1与Hsp90（E47A）与HOP和p23（黄色）启动。同样显示，GRLBD单独与F-dex（蓝色）预孵育。分析条件：50nM F-dex，1µM MBP-GRLBD，2µM Hsp40，15µM（M）Hsp70、Hsp90、HOP、p23和Bag-1。C） GRLBD（蓝色）的光散射时间过程，以及与Hsp40和Hsp70预孵育的GRLBD的（A），时间过程由Bag-1（黑色）启动。条件与B相同，但没有F-dex。另请参见图S7。

图7。GR配体结合模型
载脂蛋白GRLBD本身主要是折叠的，暂时采样一种更非结构化的状态，在这种状态下，蛋白质核心的结合囊是可接近的，允许配体结合和分离。在需要ATP水解和Hsp40的过程中，Hsp70与GRLBD结合，并通过稳定部分未折叠的非活性状态促进配体释放。当NEF Bag-1刺激Hsp70释放GRLBD时，GRLBD以部分未折叠状态快速释放，虽然能够结合配体，但容易聚集。在Hsp90存在下，GRLBD结合的Hsp70通过HOP与Hsp90结合在一起，形成一个非活性络合物。Hsp90上的后续ATP水解需要释放Hsp70（和HOP），允许进入闭合状态和p23结合。Hsp90和Bag-1一起协同促进Hsp70的释放，从而不需要Hsp90 ATP水解。与Hsp90和p23形成成熟复合物导致高亲和力配体结合。

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