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.2014年8月15日;9(8):1698-705。
doi:10.1021/cb500256u。 Epub 2014年6月17日。

亲和纯化探针用于研究肿瘤内源性Hsp70相互作用体

附属公司

亲和纯化探针用于研究肿瘤内源性Hsp70相互作用体

安娜·罗迪娜等人。 ACS化学生物. .

摘要

热休克蛋白70(Heat shock protein 70,Hsp70)是一个在调节恶性肿瘤中起关键作用的蛋白家族。癌细胞依赖Hsp70抑制细胞凋亡,调节衰老和自噬,并维持许多癌蛋白的稳定性。尽管这些在癌症中具有重要的生物学功能,但目前还没有强有力的化学工具能够以逐瘤的方式分析Hsp70调节的蛋白质组。在这里,我们利用最近报道的Hsp70配体设计并开发了一种亲和纯化化学工具集,用于研究癌症中内源性Hsp70相互作用蛋白质组。我们证明,这些工具将Hsp70与癌客户蛋白复合物锁定,并有效分离Hsp70复合物,以便通过生化技术进行鉴定。使用这些工具,我们提供了概念验证分析,以了解Hsp70在维持多种细胞特异性恶性肿瘤驱动蛋白方面发挥的复杂作用。

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图1
图1
用于Hsp70蛋白质组的Hsp70亲和探针的设计调查。(A) Hsp70伴侣的示意图循环。Hsp70的功能由ATP/ADP和结合调节核苷酸交换因子,如Hsp110。的构象Hsp70高度依赖于ATP或ADP是否结合。当ATP结合,Hsp70与底物亲和力弱的构象,当ADP结合时,它采用高亲和力的构象用于基板。通过这个循环,基板被折叠并渲染激活(功能2). 对于某些基底需要激活,蛋白质被转移到Hsp90上机械(功能1). 基于小分子的亲和力在底物结合构象中与Hsp70相互作用的探针并且,进一步将Hsp70捕获在基底中(,客户端蛋白)结合构象可能分离内源性Hsp70/客户蛋白质复合物以逐瘤方式存在。(B) 计算机生成最佳Glide约束姿势的表示化合物YK5位于Hsp70变构位点。两个潜在地点链接器的连接由红色箭头指示。效果还介绍了连接体对Hsp70介导的活性的影响。(C) 三种设计的Hsp70探针的结构。
图2
图2
探针的评估用于亲和纯化。(A) YK5-生物素1,但不是YK5-生物素2有利地渗透活细胞并保持Hsp70介导的作用。(B) 细胞提取物与指示的生物素化探针和分离的蛋白质复合物链霉亲和素珠(SB)。(C) 将细胞与YK5-生物素1一起孵育4小时或D-生物素,然后在任一SB上分离蛋白质复合物(用于YK5-生物素1)或BB70抗体(用于D-生物素)。以下在变性凝胶上分离,用指示的抗体。HC,重链;化学沉淀;IP,免疫沉淀。BB70抗体识别Hsp70、Hsc70、Grp75和Grp78。(D) 癌细胞用溶出前4小时YK5-生物素1或D-生物素的浓度以及SB上蛋白质复合物的沉淀。珠子是用低盐(LS)(25 mM NaCl)或高盐(HS)(1 M NaCl)缓冲液,如图所示,蛋白质在2%SDS中煮沸洗脱,然后在变性凝胶上分离。凝胶用考马斯蓝染色或银,如图所示。rHsp70,重组Hsp70;MW,分子重量阶梯;全裂解物,总蛋白含量。(E) 细胞是在添加YK5-生物素1和亲和力之前,用YK5预处理1小时净化如面板D所示。(F–I)试验装置如面板所示B.在面板F中,对LS缓冲液进行了修改,使其含量从25 mM氯化钠至150 mM氯化纳或氯化钾。蓝色箭头表示位置Hsp70蛋白。红色箭头表示未指定的位置蛋白质,如微管蛋白和肌动蛋白。重复这些实验两次,结果相当。
图3
图3
Hsp70的验证化学探针分离的蛋白质组。(A–C)SKBr3癌症细胞提取物与指示的生物素化物孵育过夜探针(A、C)或指示的抗体(B、C)。蛋白质复合物用链霉亲和素琼脂糖珠(A、C)或蛋白G琼脂糖分离用指示的抗体(A、C)或银探测珠子(B、C)染色(B)。(D) 用BB70或对照IgG用YK5-生物素1/SBs进行亲和纯化。用指示的抗体探测分离的蛋白质。LE和HE,低暴露和高暴露,分别(E)实验设置如图A所示的癌细胞提取物。(F) 作为在面板E中,预先孵育3小时的细胞提取物YK5的浓度。(G) 癌细胞用载体(DMSO)或YK5和蛋白质的指示浓度Western blot分析。这些实验重复了两次具有可比较的结果。

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