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.2014年7月25日；289(30):20813-23.
doi:10.1074/jbc。M114.575464。

表皮生长因子受体（EGFR）信号调节EGFR突变肺腺癌的整体代谢途径

Hideki Makinoshima先生, 高田正弘, 松本信戈, Atsushi Yagishita公司, 小和田聪, Hiroyasu Esumi先生, 竹原胜也

表皮生长因子受体（EGFR）信号调节EGFR突变肺腺癌的全球代谢途径

Hideki Makinoshima先生等。 生物化学杂志. .

摘要

肿瘤细胞中的基因突变导致几种独特的代谢表型，这些表型对癌细胞增殖至关重要。酪氨酸激酶表皮生长因子受体（EGFR）突变诱导肺腺癌（LAD）的致癌成瘾。然而，致癌突变的EGFR与癌细胞代谢之间的联系尚未明确阐明。在这里，我们发现EGFR信号在EGFR突变的LAD细胞的有氧糖酵解中起着重要作用。EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）降低乳酸生成、葡萄糖消耗和葡萄糖诱导的细胞外酸化率（ECAR），表明EGFR信号维持LAD细胞的有氧糖酵解。代谢组学分析表明，用EGFRTKI处理LAD细胞后，糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）、嘧啶生物合成和氧化还原代谢中的代谢物显著减少。在分子基础上，葡萄糖转运蛋白3（GLUT3）进行的葡萄糖转运在TKI敏感的LAD细胞中下调。此外，EGFR信号激活了氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸转氨酶和二氢鸟嘌呤酶（CAD），它们对从头合成嘧啶的第一步进行催化。我们得出结论，EGFR信号调节EGFR突变的LAD细胞中的全球代谢途径。我们的数据提供了证据，可能将治疗反应与代谢调节联系起来，这对于开发更有效的靶向治疗方法来治疗EGFR-mutated LAD患者是一个有吸引力的目标。

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图1。
图1。
EGFR-TKI治疗抑制TKI敏感性LAD细胞的乳酸生成。 A类使用吉非替尼进行WST-8分析。用指示的抑制剂处理细胞72小时，并通过WST-8分析评估其活性。数据显示为平均值±S.D(n个= 6).蓝色线条：HCC827，红线：PC-9，绿线：H1975。这个在体外半最大抑制浓度50)对于EGFR-突变的LAD细胞系的生长，确定HCC827对吉非替尼：0.085μ米，PC-9到吉非替尼：0.031μ米，和H1975对吉非替尼：>10μ米.B类用厄洛替尼进行WST-8分析。用指定浓度处理细胞72小时，并通过WST-8分析评估细胞活力。数据显示为平均值±S.D(n个= 6).蓝色线条：HCC827，红线：PC-9，绿线：H1975。这个在体外半最大抑制浓度50)对于EGFR突变的LAD细胞系的生长，测定HCC827至0.065μ米，PC-9至0.067μ米和H1975至8.8μ米.C类，HCC827和PC-9中的中等颜色通过添加EGFR-TKIs（1μ米)培养基中的酚红在pH值8.0至6.6范围内呈现从红色到黄色的渐变。D类，6小时至1μ时的细胞生长反应米使用台盼蓝染色法测量吉非替尼或埃洛替尼的浓度。HCC827的细胞数(蓝色)，PC-9(红色)显示了、和H1975。全球环境基金；吉非替尼，ERLO；厄洛替尼。数据显示为平均值±S.D(n个= 4). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。E类HCC827中细胞外乳酸的产生(蓝色)，PC-9(红色)和H1975(绿色)TKI处理后6小时的细胞系。误差条指示S.D(n个= 6). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。
图2。
图2。
葡萄糖消耗和流量分析监测葡萄糖代谢。 A类，HCC827中的葡萄糖消耗率(蓝色)，PC-9(红色)和H1975(绿色)单元格。细胞在没有或存在EGFR-TKIs的情况下培养24小时，并量化培养上清液中的葡萄糖浓度。采用无细胞培养基作为背景对照。误差条指示S.D(n个= 6). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。B类，ECAR随时间的测量。用TKIs处理6小时后，对细胞进行通量测定。每9分钟测量一次ECAR。添加葡萄糖、寡霉素和2-脱氧-d日-葡萄糖(2DG公司)在箭头误差条表示S.D。C类，HCC827的ECAR值(蓝色)，PC-9(红色)和H1975(绿色)细胞在36分钟的通量分析。误差条指示S.D(n个= 24–30). **,第页< 0.005; ***,第页< 0.001与双尾学生控制t吨测试。所有细胞均用指示的TKI（1μ米)每次分析前6小时。全球环境基金吉非替尼；ERLO公司，厄洛替尼。D类，HCC827的OCR值(蓝色)，PC-9(红色)和H1975(绿色)细胞在36分钟的通量分析。误差条指示S.D(n个= 24–30). *,第页< 0.001与双尾学生控制t吨测试。所有细胞均用指示的TKI（1μ米)每次分析前6小时。全球环境基金吉非替尼；ERLO公司，厄洛替尼。
图3。
图3。
EGFR信号上调糖酵解和磷酸戊糖途径。参与糖酵解和磷酸戊糖途径的关键代谢物的细胞内浓度（pmol/百万细胞）(购买力平价)在显示出对EGFR信号传导的抑制之后。误差条指示S.D(n个= 3). 用甲醇从经过二甲基亚砜处理的HCC827、PC9或H1975细胞中提取总代谢物(蓝色)或厄洛替尼(红色, 1 μ米)6小时。代表性代谢物，如6-磷酸葡萄糖(g6便士)，1,6-二磷酸果糖(固定基地计划)，3-磷酸甘油醛(G3P公司)，二羟丙酮磷酸酯(DHAP公司)，3-磷酸甘油(第三方集团)，磷酸烯醇丙酮酸(政治公众人物)，丙酮酸盐(PA公司)，乳酸(洛杉矶)，6-磷酸葡萄糖酸盐(6页)，5-磷酸核酮糖(俄罗斯5P)，5-磷酸核糖(5便士)，和ATP显示在这里。其他列在补充表1.
图4。
图4。
MYC调节糖酵解基因表达。 A类、蛋白质印迹(工作分解结构)显示了与EGFR信号传导相关的蛋白质。EGFR、磷酸化EGFR(对-表皮生长因子受体)、ERK1/2、磷酸-ERK1/2(p-ERK1/2型)、AKT、磷酸-AKT(对AKT)和c-MYC。从用吉非替尼处理2 h的细胞中分离出总蛋白裂解物。对全细胞裂解物中等量的蛋白质进行Western blot分析，以检测指示的蛋白质。β-肌动蛋白作为负荷对照。B-E公司TKI处理后6h从细胞中分离出总RNA，并进行RT-PCR分析。蓝色条代表DMSO控制，红色条表示吉非替尼治疗，以及绿色条表示厄洛替尼治疗。此处显示了与糖酵解相关的代表性基因。MYC公司,GLUT1公司（葡萄糖转运蛋白1，SLC2A1型),香港2号（己糖激酶2），以及PKM2（平方公里）（丙酮酸激酶肌肉同工酶2）等补充表S2误差条指示S.D(n个= 6). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。
图5。
图5。
代谢酶的蛋白质表达和磷酸化。 A类添加EGFR-TKI 24小时后，Tyr-105处PKM2的磷酸化降低。在TKI敏感的HCC827和PC9细胞中EGFR的抑制在治疗后2或6小时均未诱导磷酸化PKM2的显著降低。B类Western blotting显示与致癌信号、GLS、GYS、GLUTs、HKII、PDHA1和磷酸化PDHA1相关的蛋白质。从用吉非替尼或埃洛替尼处理6小时的细胞中分离总蛋白质裂解物。对来自全细胞裂解物的等量蛋白质进行蛋白质印迹分析以检测所指示的蛋白质。β-肌动蛋白作为负荷对照。
图6。
图6。
葡萄糖转运效率是与EGFR信号相关的葡萄糖代谢中最快速、最关键的调节功能。 A类，厄洛替尼（1μ米)固定后，用兔抗GLUT3抗体和FITC-偶联抗兔二级抗体对细胞进行染色。B类流式细胞术分析HCC827细胞中GLUT3的表达。蓝色条用IgG同型控制显示背景荧光红色条用抗GLUT3抗体表示荧光染色结果。误差条表示S.D(n个= 4). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。C类，厄洛替尼（1μ米)固定后，用兔抗GLUT3抗体和FITC-偶联抗兔二级抗体对细胞进行染色。D类流式细胞术分析PC9细胞中GLUT1的表达。蓝色条用IgG同型控制显示背景荧光红色条用抗GLUT3抗体表示荧光染色结果。误差条表示S.D(n个= 4). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。E类，厄洛替尼（1μ米)固定后，用兔抗GLUT3抗体和FITC-偶联抗兔二级抗体对细胞进行染色。F类流式细胞术分析TKI耐药H1975细胞中GLUT3的表达。蓝色条用IgG同型控制显示背景荧光红色条用抗GLUT3抗体表示荧光染色结果。误差条表示S.D(n个= 4). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与双尾学生控制t吨测试。克和H（H）, 3-O（运行）-([三H] 甲基）-d日-HCC827中葡萄糖（3-OMeG）转运效率(克)和PC-9(H（H）)与DMSO对照组相比，细胞对吉非替尼或厄洛替尼的反应。用指示的TKI（1μ米)在转运试验前保持6小时。随时间测量放射性。在1分钟时收获细胞(蓝色)和10分钟(红色)添加3-OMeG后。误差条指示S.D(n个= 4). *,第页< 0.001与双尾学生控制t吨测试。
图7。
图7。
EGFR信令保持从头开始嘧啶生物合成途径。 A类代谢组分析。参与糖酵解和磷酸戊糖途径的关键代谢物的细胞内浓度（pmol/百万细胞）(购买力平价)EGFR信号被抑制后。误差条指示S.D(n个= 3). 用甲醇从经过二甲基亚砜处理的HCC827、PC9或H1975细胞中提取总代谢物(蓝色)或厄洛替尼(红色, 1 μ米)持续6小时。代表性代谢产物，如富马酸盐(FA公司)，苹果酸(妈妈)，天冬氨酸(天冬氨酸),N个-氨甲酰天冬氨酸（NC-Asp），NAD+，NADH，还原性谷胱甘肽(谷胱甘肽)和氧化性谷胱甘肽(GSSG公司)如图所示。B类，Western blot显示与从头开始嘧啶合成。从吉非替尼（1μ米)或厄洛替尼（1μ米)对全细胞裂解物中等量的蛋白质进行Western blot分析，以检测指示的蛋白质。核糖体蛋白S6激酶1（S6K）、磷酸-S6K（p-S6K，Thr421/Ser424）和氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢orotase（CAD）和磷酸-CAD（p-CAD，Ser-1859）显示。
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