13C isotope-assisted methods for quantifying glutamine metabolism in cancer cells

doi:10.1016/B978-0-12-416618-9.00019-4

.2014:542:369-89.

doi:10.1016/B978-0-12-416618-9.0019-4。

13C同位素辅助的肿瘤细胞谷氨酰胺代谢定量方法

张杰（音译）¹, 吴淑安¹, 保罗·加梅罗¹, 马克·凯布勒¹, 张哲¹, 斯特凡诺普洛斯²

附属公司

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系。
²美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系电子地址：gregstep@mit.edu。

PMID： 24862276
PMCID公司：项目经理4392845
内政部： 2016年10月10日/B978-0-12-416618-9.0019-4

13C同位素辅助定量癌细胞谷氨酰胺代谢的方法

张杰（音译）等。酶学方法. 2014.

.2014:542:369-89.

doi:10.1016/B978-0-12-416618-9.0019-4。

作者

张杰（音译）¹, 吴淑安¹, 保罗·加梅罗¹, 马克·A·凯布勒¹, 张哲¹, 斯特凡诺普洛斯²

附属公司

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系。
²美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系电子地址：gregstep@mit.edu。

PMID： 24862276
PMCID公司：项目经理4392845
内政部： 2016年10月10日/B978-0-12-416618-9.0019-4

摘要

谷氨酰胺最近已成为支持癌细胞增殖的关键底物，其代谢流量的量化对于理解这种氨基酸参与维持肿瘤细胞生存和生长的代谢重组的机制至关重要。谷氨酰胺代谢包括两条主要途径，即谷氨酰胺水解和还原羧基化，这两条途径都始于谷氨酰胺脱氨基生成谷氨酸和谷氨酸转化为α-酮戊二酸。在谷氨酰胺水解过程中，α-酮戊二酸通过三羧酸循环氧化并脱羧生成丙酮酸。在还原羧基化过程中，α-酮戊二酸被还原转化为异柠檬酸，异柠檬酸异构化为柠檬酸，为从头开始的脂肪生成提供乙酰辅酶A。在这里，我们描述了通过这两种途径量化谷氨酰胺代谢流量的方法，以及谷氨酰胺对脂质合成的贡献。提供了这些方法如何应用于研究肿瘤相关代谢途径的示例。

关键词：癌细胞；谷氨酰胺代谢；代谢通量；还原羧基化；稳定同位素示踪剂；三羧酸循环。

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数字

**图19.1。哺乳动物细胞中的谷氨酰胺代谢**
图中显示了哺乳动物细胞中谷氨酰胺代谢的两条主要途径，即谷氨酰胺水解和还原羧基化。在这两种途径中，谷氨酰胺首先脱氨基生成谷氨酸，然后通过谷氨酸脱氢酶（GDH）或转氨作用转化为α-酮戊二酸。在谷氨酰胺水解过程中，α-酮戊二酸通过TCA循环氧化为苹果酸，然后通过苹果酸酶（ME）脱羧生成丙酮酸，或通过苹果酸脱氢酶（MDH）氧化为草酰乙酸。在还原羧基化反应中，α-酮戊二酸通过异柠檬酸脱氢酶（IDH）还原转化为异柠檬酸，然后异柠檬酸异构化为柠檬酸。缩写：LDH，乳酸脱氢酶；丙酮酸脱氢酶；CS，柠檬酸合成酶；ACL、ATP柠檬酸裂解酶；ACO，乌头碱；OGDH，酮戊二酸脱氢酶；琥珀酸脱氢酶；FH，富马酸酶；苹果酸脱氢酶；GLS，谷氨酰胺酶。

**图19.2。同位素示踪实验研究癌症代谢的典型流程**
该方案总结了同位素示踪辅助癌症代谢研究的主要步骤以及需要考虑的常见因素，这些将在本节中进行讨论。

**图19.3。[U的碳原子跃迁图-¹³C类₅]谷氨酰胺**
这张地图说明了[U-¹³C类₅]TCA循环中的谷氨酰胺和棕榈酸酯(¹²C原子由空圆圈表示¹³C原子由填充圆表示）。RC产生的质量异构体包括M5柠檬酸盐（Cit）、M3草酰乙酸盐（Oac）、M3天冬氨酸盐（Asp）、M3苹果酸盐（Mal）和M3富马酸盐（Fum）。氧化代谢产生的质量同位素包括M4 Cit、M4琥珀酸（Suc）、M4 Fum和M4 Oac。RC和谷氨酰胺水解（未显示）均产生完全标记的乙酰辅酶A（M2 AcCoA）。为简单起见，未显示分子对称性和细胞隔室引起的标记模式。图中显示了TCA循环的第一轮，并描述了相关代谢物的位置标记。

**图19.4。[1的碳原子跃迁图-¹³C] 谷氨酰胺和[5-¹³C] 谷氨酰胺**
地图说明了[1的命运-¹³C] 和[5-¹³C] 谷氨酰胺用于追踪*还原的*TCA循环（碳原子用圆圈表示）。[1-¹³C] 谷氨酰胺衍生同位素标记（灰圈）在α-酮戊二酸氧化过程中丢失，但在还原TCA循环中保留，并转移到柠檬酸盐和下游代谢物。[5-¹³C] 谷氨酰胺衍生同位素标记（黑圈）通过RC并入乙酰辅酶A和脂肪酸只有; [5的同位素标记-¹³C] 谷氨酰胺不能通过氧化TCA循环转化为脂肪酸。含有乙酰辅酶A碳骨架的代谢物以虚线圆圈突出显示。为简单起见，未显示分子对称性和细胞隔室引起的标记模式。位置标记仅适用于相关代谢物。

**图19.5。同位素谱分析（ISA）方法**
¹³C标记的葡萄糖示踪剂用于追踪葡萄糖到脂质的流量。葡萄糖衍生的¹³C原子和内源性来源（例如，醋酸盐和谷氨酰胺）有助于形成脂肪生成乙酰辅酶A库。这个D类参数表示葡萄糖示踪剂对脂肪生成乙酰辅酶A的未知部分贡献（或相对流量）。在与示踪剂孵育期间，棕榈酸由八个乙酰辅酶A分子合成。新合成的棕榈酸酯与现有棕榈酸酯池（添加示踪剂之前）和*从头开始*一段时间后棕榈酸合成，t吨是克(t吨). 每个条形图表示棕榈酸酯MID。由于天然丰度，先前存在的棕榈酸酯具有显著的M1富集。参数D类和克(t吨)通过将预测值与取样棕榈酸酯中测得的MID进行拟合来估算。

**图19.6：。缺氧案例研究数据**
代表性数据基于作者之前关于RC和缺氧的研究。（A）在常氧和缺氧条件下A549细胞中谷氨酰胺和谷氨酸的细胞特异性摄取和分泌速率。（B）总谷氨酰胺和RC-甲基化谷氨酰胺对多个癌细胞系的脂肪生成乙酰辅酶A的部分贡献，由ISA测定。（C）在常氧和缺氧条件下，葡萄糖氧化和谷氨酰胺衍生αKG减少对A549细胞脂质合成的部分贡献。（D）在[1中培养时，含有M1标签的TCA循环代谢物分数-¹³C] 在常氧和缺氧条件下A549细胞中的谷氨酰胺。（E） Small-hairpin RNA诱导的*印尼盾1*但不是*IDH2公司*在[1中培养的各种癌细胞株中柠檬酸盐M1标记的表达降低-¹³C] 谷氨酰胺。

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