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.2014年6月12日；7(5):1679-1690.
doi:10.1016/j.celrep.2014.04.037。 Epub 2014年5月22日。

α-酮戊二酸的氧化是线粒体缺陷癌细胞还原羧基化所必需的

安德鲁·R·马伦 1, 胡泽平 1, 史晓蕾 1, 雷江 1, 林赛K区 1, 佐尔坦科瓦茨 2, 理查德·鲍里亚克 三, 迪内什·拉赫亚 三, 卢卡斯·B·沙利文 4, W马斯顿·莱尼汉 5, Navdeep S Chandel公司 4, 拉尔夫·德贝拉迪尼斯 6
附属公司

线粒体缺陷癌细胞还原羧化需要α-酮戊二酸的氧化

安德鲁·马伦等。 单元格代表. .

摘要

哺乳动物细胞通过线粒体中的丙酮酸脱羧产生柠檬酸盐，以提供三羧酸（TCA）循环。相反，缺氧和线粒体功能的其他损伤通过NADPH依赖性异柠檬酸脱氢酶（IDH）对α-酮戊二酸（AKG）进行还原羧基化，从而诱导产生柠檬酸盐的替代途径。目前尚不清楚在线粒体损伤的情况下，细胞如何产生必要的还原当量来提供还原羧基化。在这里，我们使用还原羧基化鉴定了细胞中的共同代谢特征。矛盾的是，在TCA循环中，还原羧基化伴随着AKG氧化。抑制AKG氧化会降低等效有效性并抑制还原羧基化。烟酰胺核苷酸转氢酶阻断还原当量从NADH转移到NADPH，增加NADH丰度，降低NADPH丰度，同时抑制还原羧基化。数据表明，还原羧基化需要沿着氧化和还原途径进行双向AKG代谢，而氧化途径产生的还原当量用于反向操作IDH。

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数字

图1
图1。还原羧基化细胞的代谢组学特征
（A）从143B的三份样品中提取的代谢物的相对丰度重量，143B年cytb公司、UOK262FH和UOK62EV电池。将每种代谢物的峰面积归一化为蛋白质丰度。颜色反映原木2比例尺。（B）用于生成（A）中热图的十二种提取物的主成分分析。（中-英）通过还原羧基化作用，代谢产物在细胞中表现出一致且显著的丰度变化。在所有情况下，第页每对细胞系之间的比较<0.005。（F）ETC活性受损诱导的几种还原羧基化模型中琥珀酸的丰度。高剂量二甲双胍和鱼藤酮抑制复合物I。抗霉素抑制复合物III。低氧作为复合物IV的抑制剂发挥作用。这些治疗均适用于143B重量细胞。CCL16-B2是中国仓鼠成纤维细胞，由于NDUFA1型突变。CCL16-ND11细胞是通过用酵母NADH醌氧化还原酶（NDI1）稳定感染CCL16-B2而产生的，该酶可恢复氧化能力并消除还原羧基化。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05; **第页<0.005，学生t检验。NS，不显著。
图2
图2。氧化谷氨酰胺代谢是细胞内琥珀酸形成的主要途径，通过还原羧基化生成柠檬酸盐
（A-C）1430亿重量细胞在含有未标记的葡萄糖和[U-13C] 谷氨酰胺，以及琥珀酸、富马酸和苹果酸的标记模式。四个同极性13C原子（m+4）是通过氧化代谢形成的（绿色），并且具有三个13C原子（m+3）通过还原代谢形成（红色）。标签方案见图S2。（D-F）1430亿cytb公司细胞在含有未标记葡萄糖和[U-13C] 谷氨酰胺和琥珀酸、富马酸和苹果酸的标记模式如（A-C）所示。注意，琥珀酸的形成主要是氧化性的，但富马酸和苹果酸的形成几乎完全是还原性的，表明谷氨酰胺的双向代谢。
图3
图3。丙酮酸羧化酶通过还原羧化作用促进细胞内柠檬酸盐的形成
（A-B）143B和UOK262细胞用[3,4-13C] 分析了苹果酸和柠檬酸中的葡萄糖和未标记的谷氨酰胺以及标记模式。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05; **第页<0.005，学生t检验。（C）左，143B中丙酮酸羧化酶（PC）蛋白的丰度cytb公司稳定表达非靶向（shGFP）或靶向PC的两个独立发夹（shPC_1，shPC_2）的细胞。细胞与[3,4-13C] 葡萄糖和未标记的谷氨酰胺（中间），或未标记的葡萄糖和[U-13C] 分析谷氨酰胺和标记模式。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05; **第页<0.005，学生t检验。
图4
图4。琥珀酸丰度的提高对于还原羧基化是不必要的
（A）琥珀酸-CoA连接酶α亚基的丰度（由SUCLG1公司)143B年胞苷用对照siRNA（siLUC）或siRNA转染的细胞吸盘1（siSUCLG1）。（B）143B年琥珀酸的相对丰度胞苷以下瞬间击倒LUC公司或SUCLG1公司数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（C）含有五种谷氨酰胺衍生物的柠檬酸部分13瞬时击倒后的C核（m+5）LUC公司或SUCLG1公司和[U-13C] 谷氨酰胺和未标记葡萄糖。数据是三种独立文化的平均值和S.D。NS，不显著。
图5
图5。还原羧基化需要AKG脱氢酶
（A）143B中OGDH蛋白的丰度cytb公司用对照siRNA（siLUC）或siRNA转染的细胞OGDH公司（siOGDH）。（B）143B年琥珀酸的相对丰度cytb公司siLUC或siOGDH瞬时击倒后的细胞。数据是三种独立文化的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（C）瞬时击倒143Bcytb细胞后m+5标记柠檬酸的丰度LUC公司或OGDH公司用[U培养-13C] 谷氨酰胺和未标记葡萄糖。通过将相对柠檬酸盐池大小乘以柠檬酸盐m+5的百分比，计算标记柠檬酸盐的丰度。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（D）143B中OGDH蛋白的丰度重量瞬时转染的细胞LUC公司或OGDH公司.（E）143B中柠檬酸盐与AKG的比例重量细胞敲除后LUC公司或OGDH公司数据是四种独立培养物的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（F）143B年柠檬酸盐的质量同位素分布重量短暂击倒后的细胞LUC公司或OGDH公司并与[U-13C] 谷氨酰胺和未标记葡萄糖。数据是三种独立文化的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（G）Western blot显示富马酸水合酶在UOK262细胞中的表达，该酶缺乏线粒体靶向序列并含有V5表位标签（FHΔMTS）。EV，空矢量。（H）含有或缺乏FHΔMTS的UOK262细胞中富马酸的相对丰度。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（一）柠檬酸在含有或缺乏FHΔMTS的UOK262细胞中的质量同位素分布。数据是三种独立文化的平均值和S.D。NS，不显著。
图6
图6。AKG脱氢酶和NNT有助于NAD+/NADH比率
（A）143B年NADH的双光子荧光成像重量和143Bcytb公司红色表示NADH丰度增加的区域。比例尺22μm。（B）143B年NAD+/NADH比率重量和143Bcytb公司细胞。数据是3-4种独立文化的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（C）143B年NAD+/NADH比率cytb公司用抗荧光素酶（siLUC）的siRNAs瞬时转染后，或奥格德（siOGDH）。数据是3-4个独立实验的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（D）143B年NAD+/NADH比率胞苷用siLUC转染后）或针对尼古丁核苷酸转氢酶（siNNT）的siRNA池。数据是3-4个生物重复的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（E）143B中m+5标记柠檬酸盐的丰度cytb公司转染siLUC或siNNT的细胞以及培养[U-13C] 谷氨酰胺。标记柠檬酸盐的丰度是通过将总柠檬酸盐相对丰度乘以m+5同位素的分数贡献来计算的。数据是三种独立文化的平均值和S.D**第页<0.005，学生t检验。（F）143B年NADP+/NADPH比率cytb公司用siLUC或siOGDH瞬时转染后的细胞。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（G）143B年NADP+/NADPH比率cytb公司用siLUC或siNNT瞬时转染后的细胞。数据是三种独立文化的平均值和S.D*第页<0.05，学生t检验。（H）143B年NADP+/NADPH比率cytb公司用siLUC或siIDH2瞬时转染后的细胞。数据是三种独立文化的平均值和S.D。插图是描述IDH2蛋白在两种情况下的丰富性的western blot*第页<0.05，学生t检验。（一）143B还原羧基化诱导模型cytb公司细胞。通过AKG-pdehydrogenase的通量生成琥珀酸和NADH，在还原羧基化过程中被NNT耗散以生成NADPH。
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