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.2014年5月21:5:3869。
doi:10.1038/ncomms4869。

靶向整合素的纳米粒子形成的siRNA抑制小鼠肝癌进展

罗曼·博戈拉德 1, 郝茵 1, 安贾·齐格勒 2, 野中秀内里 2, 维拉·鲁达 三, 马里诺·泽里尔 2, 丹尼尔·安德森 4, 维克托·科特利安斯基 5
附属公司

靶向整合素的纳米粒子形成的siRNA抑制小鼠肝癌进展

罗曼·博戈拉德等。 国家公社. .

摘要

整合素在发育、调节细胞分化、增殖和存活过程中发挥着重要作用。在这里，我们发现整合素亚基的敲除减缓了肝细胞癌（HCC）的进展。使用靶向β1和αv整合素亚单位的短干扰RNA纳米微粒传递，我们下调了肝细胞中的所有整合素受体。短期整合素敲除（2周）不会对正常肝组织造成明显的结构或功能紊乱。肝脏形态的改变在持续的整合素下调中积累（7周）。整合素的敲除导致HCC进展显著延迟，减少增殖并增加肿瘤细胞死亡。这种肿瘤阻滞伴随着MET癌基因的激活减少以及其成熟形式在细胞表面的表达减少。我们的数据表明，肝癌转化增殖细胞比正常静止肝细胞对整合素的敲除更为敏感，这突显了小干扰RNA介导的整合素抑制作为一种抗癌治疗方法的潜力。

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数字

图1
图1。RNAi介导的Itgb1肝沉默
一在注射siRNA三天后，剂量依赖性Itgb1 mRNA敲除（n=4-5，平均值±标准偏差，p水平–通过土耳其事后测试与si-对照治疗组进行比较，b条、单剂量siRNA（0.5 mg kg）后Itgb1敲低mRNA和蛋白质水平的时间进程−1，n=3）。经si-Itgb1处理的动物的mRNA水平p<0.001（通过土耳其事后检验，与经si-对照处理的动物相比，时间点为3–24天。通过土耳其事后检测，Itgb1蛋白水平与经si-control处理的动物比较图表上的p-水平。c（c）时间进程的代表性西方污点。d日，通过流式细胞术分析从用Itgb1 siRNA处理两次的动物分离的肝细胞上的Itgb1表达。（−/+1°AB–添加同型对照/一级抗体）。数字表示将si-Itgb1处理的细胞归一化为对照组之一的荧光强度的几何平均值，表示为平均值±s.e.m。对于其他整合素亚基表达的广泛分析，其定量补充图2，对于mRNA敲除定量，参见补充图2d。e（电子）、免疫荧光染色分析Itgb1的表达，肝细胞上的表达（红箭头侧表面和白箭头基底表面）。比例尺，20µm。
图2
图2。成年和生长期小鼠整合素敲除后肝脏的组织学分析
一，8周大的动物接受了2次0.5 mg kg的注射（每周一次）−1每种特定siRNA。对照动物接受1.0 mg kg−1在对照siRNA中，将si-Itgb1和si-Itgav组的剂量调整为0.5 mg kg−1最后一次注射后7天，对动物进行安乐死，并对肝脏切片进行血红素-伊红染色。比例尺–400µm，b、 c（c）从出生后七天开始，未成年小鼠接受六次静脉注射si-Itgb1，每周两次。b条，Itgb1敲除的免疫荧光分析。比例尺–50µm。c（c），肝细胞增殖免疫荧光分析，Ki67染色。比例尺–100µm。
图3
图3。Itgb1敲除调节肝细胞粘附和形态体内和体外
一，Itgb1的下调减少了分离肝细胞与细胞外基质蛋白的粘附体外，（n=3）。b条，肝细胞中Itgb1的下调影响肝细胞恢复极性的能力体外箭头表示在胶原夹层中培养时肝细胞中的细胞间隙（顶端结构域）发生了重组。每个处理都有三个独立的字段，比例尺，20µm。a–b，从接受si-Itgb1治疗10天（两次注射）的小鼠中分离肝细胞。c（c），Itgb1的长期沉默导致肝细胞顶端结构域（胆管）扭曲体内，通过Cd13本地化可视化（箭头）。扩大的肝细胞亚群（星号）显著扩大。比例尺，50µm。d日，用si-Itgb1处理10周的动物肝细胞表面的分布。使用Image J软件（每组4个），在指骨样蛋白染色的肝脏切片上评估细胞表面（每只动物约100个细胞）。e（电子），长期（10周）敲除Itgb1对经si-Itgb1治疗10周的成年小鼠肝细胞顶端结构域（小管）的影响。箭头表示泪小管扭曲。比例尺–50µm，（f）α-平滑肌肌动蛋白（α-Sma）免疫荧光染色证明活化星状细胞丰度增加。比例尺–100µm。
图4
图4。LNP制备的siRNA诱导自发性肝癌结节的高效敲除
a–bWestern blot分析肿瘤诱导10周后从动物身上采集的血清样本中的α-fetoprotein水平。Afp水平比较了给药前、上组和注射siRNA后三天、下组，（n=3，平均值±标准偏差，p-水平——通过土耳其事后检验进行比较）。c（c），通过qPCR分析肿瘤结节和邻近肝组织中Itgb1沉默的剂量反应，注射后一天收集的组织（n=3，平均值±标准偏差，通过土耳其事后检验进行比较）。d日Western blot分析经si-Itgb1的si-Control治疗两周的肝脏肿瘤中Itgb1水平。e（电子），western blot定量(d日)，n=4，平均值±标准偏差，通过学生t检验进行比较，（f），肿瘤组织中Itgb1的免疫荧光染色（用si-Itgb1治疗两周后）。肿瘤节点用白色虚线表示。红色箭头表示肿瘤细胞上Itgb1的表达。比例尺，50µm。参见补充图11-12。
图5
图5。RNAi介导的Itgb1沉默减少自发性肝癌的进展
一、实验示意图、肿瘤诱导时间表（注射癌基因编码质粒）和重复注射LNP配制的siRNA，在注射质粒后10周收集组织进行分析，b–c类对肝脏进行宏观分析，箭头表示表面肿瘤结节。肝脏/体重比分析，平均值±标准偏差，p水平——土耳其事后分析的比较，d日，通过qPCR分析HCC标志物甲胎蛋白mRNA的表达（平均值±s.e.m.p水平——通过土耳其事后分析进行比较），e（电子），肝癌组织的苏木精-伊红染色。比例尺，100µm。插入物代表HCC结节，条形-50µm。（f）Kaplan-Meier对编码经PBS、对照或抗Itgb1 siRNA处理的癌基因的质粒交付后无病态时间的分析，n=8-10（p<0.002，logrank检验）。NTC–非肿瘤对照小鼠。
图6
图6。Itgb1沉默对肿瘤细胞增殖和存活的影响体内
一Ki67染色用于分析肿瘤细胞的增殖，棕色细胞核表示阳性细胞（箭头）。比例尺，200µm。b条，通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析肿瘤结节中的细胞死亡，红色细胞核代表TUNEL阳性细胞。比例尺，200µm。c–d码，分析用对照或Itgb1 siRNA治疗的荷瘤肝脏中裂解caspase 3（p17）的表达（n=3-4，平均值±s.e.m.，通过土耳其事后检验进行比较）。Itgb1击倒验证见图8a，e（电子），对Cclna1、Cclnd1、Gas2l3、Ckap2、Cdkn3、Gadd45b、Birc2、Axin2的表达进行qPCR分析（n=5-6，平均值±标准偏差，通过土耳其事后检验进行比较）。NTC–非肿瘤对照小鼠
图7
图7。Itgb1下调对小鼠肝癌MET信号转导和表达的影响
一，分析用siRNA处理的肿瘤组织中MET和β-catenin的表达和磷酸化。b条，Western印迹(a）量化，（n=3-4，平均值±s.e.m.，通过土耳其事后检验进行比较）。Itgb1击倒验证见图8a，c（c）、肿瘤结节中MET和β-catenin表达的免疫组织化学分析。相应地，比例尺为100µm和400µm。箭头-细胞质和箭头-MET的膜表达。d日，qPCR分析hβ连环蛋白和hMET癌基因mRNA水平，（n=5。通过土耳其事后检验与si-对照治疗组的p水平比较，e，用siRNA处理的Hep3B细胞中MET、ITGB1和磷酸化FAK的表达。（f），量化(e（电子）)采用Student t检验对4-6个独立转染进行分析，平均值±标准偏差，p水平进行比较。克，通过qPCR确认Hep3B细胞中ITGB1 mRNA敲除以及MET和CTTB1 mRNA水平，平均值±标准偏差，p水平-通过Student t检验进行比较。NTC–非肿瘤对照小鼠。浅灰色–si-对照处理的细胞，深灰色–si-Itgb1处理的细胞。
图8
图8。抗Itgb1的siRNA减少自发性肝癌中各种信号通路的过度激活
一，用对照siRNA处理的肿瘤组织的蛋白质印迹分析，b条，western blot定量（a）（n=3–4，平均值±s.e.m.，通过土耳其事后检验进行比较），c（c），肝组织中磷酸化Stat3表达的免疫组织化学分析（箭头表示细胞核染色阳性）。比例尺，100µm。NTC–非肿瘤对照小鼠。
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