Mechanism for neutralizing activity by the anti-CMV gH/gL monoclonal antibody MSL-109

doi:10.1073/pnas.1404653111

.2014年6月3日；111(22):8209-14.

doi:10.1073/pnas.1404653111。 Epub 2014年5月19日。

抗CMV gH/gL单克隆抗体MSL-109的中和作用机制

阿什利·E·福茨¹, 拉提亚·康普斯·阿格拉尔², 凯萨琳娜·施滕格尔（Katharina F Stengel）^三, 迭戈·埃勒曼², 艾琳·J·舍弗勒⁴, 瑟伦取暖⁵, 丹·L·伊顿², 贝克特·费尔巴赫⁶

附属公司

¹传染病科。
²蛋白质化学。
^三结构生物学、早期发现生物化学和。
⁴早期发现生物化学，和。
⁵分子生物学，Genentech Inc.，加利福尼亚州南旧金山，94080。
⁶传染病科，becketf@gene.com。

PMID： 24843144
预防性维修识别码：项目经理4050585
内政部： 10.1073/pnas.1404653111

抗CMV gH/gL单克隆抗体MSL-109的中和作用机制

阿什利·E·福茨等人。美国国家科学院程序. 2014.

.2014年6月3日；111(22):8209-14.

doi:10.1073/pnas.1404653111。 Epub 2014年5月19日。

作者

阿什利·E·福茨¹, 阿格拉伯爵夫人², 凯萨琳娜·施滕格尔（Katharina F Stengel）^三, 迭戈·埃勒曼², Allyn J舍弗勒⁴, 瑟伦取暖⁵, 丹·L·伊顿², 贝克特·费尔巴赫⁶

附属公司

¹传染病科。
²蛋白质化学。
^三结构生物学、早期发现生物化学和。
⁴早期发现生物化学，和。
⁵分子生物学，Genentech Inc.，加利福尼亚州南旧金山，94080。
⁶传染病科，becketf@gene.com。

PMID： 24843144
预防性维修识别码：项目经理4050585
内政部： 10.1073/pnas.1404653111

摘要

巨细胞病毒（CMV）是一种广泛存在的机会性病原体，经胎盘传播时会导致出生缺陷，并在免疫缺陷患者中引起严重的全身性疾病。MSL-109是一种从CMV血清阳性个体分离的人单克隆IgG，与CMV入口糖蛋白H（gH）结合并防止细胞感染。在此，我们提出了MSL-109中和活性的机制。我们定义了MSL-109耐药性的遗传基础，并生成了gH的结构模型，该模型揭示了该中和抗体的表位。使用基于表面的时间分辨FRET，我们证明gH/gL与糖蛋白B（gB）相互作用。此外，我们检测了可溶性gH/gL异二聚体的同型二聚体，并证实了在细胞表面表达的全长gH/gL上的这种新型寡聚体组装。我们表明，MSL-109干扰了gH/gL的二聚化：gH/gL，这表明gH/gL的二聚化可能是感染性所必需的。由于CMV和HSV gH/gL在FRET系统中都表现出自结合，因此α-病毒和β-病毒之间可能存在gH/gL-同二聚体。这项研究为MSL-109的一种新的作用机制提供了证据，并揭示了之前未描述的病毒进入的一个方面，该方面可能容易受到治疗干预。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：本作品的所有作者均为Genentech，Inc./Hoffmann La-Roche的员工，并持有该公司的股权。

数字

**图1。**
MSL-109抗性病毒的产生。(一)将多重感染（MOI）为1的病毒与次优浓度的MSL-109混合，并添加到上皮细胞（ARPE-19）或成纤维细胞（MRC-5）中。每周，将一半的上清液传到新细胞上，抗体浓度增加1.5倍，最终浓度为10×EC₉₀。病毒以星号表示，抗性病毒以红星表示。(B类)将病毒暴露于诱变剂（ENU或UV）并添加到细胞中。在感染第二轮之前，向细胞中添加完全中和的MSL-109。(C类)从MSL-109抗性病毒中分离的gH蛋白突变表。表中包括了用于突变产生的方法和细胞类型。对照组在ARPE-19细胞中并行传播。氨基酸168和171的突变被独立地获得多次，而D446N仅获得一次。

**图2。**
耐MSL-109菌株的特性。(一和B类)MSL-109中和分析(左侧)和10F8(赖特)MSL-109耐药菌株的抗体(一)上皮细胞（ARPE-19）或(B类)成纤维细胞（MRC-5）。抗体被连续稀释，并与一定量的病毒混合，使最终病毒离子浓度为1。细胞被感染18小时，并使用带有抗CMV-IE抗体的免疫荧光进行定量。数据经过对数转换，归一化为无抗体感染，并使用Prism（GraphPad软件）绘图。(C类和D类)耐药菌株的细胞进入分析(C类)上皮细胞或(D类)成纤维细胞。使用病毒基因pp65的定量PCR测定DNA拷贝数，并用于感染细胞。被感染的细胞被量化，数据被记录为每百万份DNA中的感染病毒。误差条代表六种感染的SD。(E类)MSL-109中和试验(左侧)和10F8(赖特)FIX-BAC衍生菌株上的抗体。

**图3。**
MSL-109与野生型和耐药gH/gL的相互作用(一)与细胞表面表达的gH/gL结合的MSL-109或10F8抗体的FACS图谱。将含有野生型或突变gH/gL/eGFP的质粒转染COS-7细胞。仅显示GFP表达细胞。这个年轴表示抗体结合（即APC强度），阳性细胞占GFP的百分比⁺细胞。(B类)具有蓝色、绿色和红色突出显示的抗性突变的CMV gH的理论模型(C类)具有MSL-109 FAb（金）晶体结构的CMV gH的理论模型以抗性突变（蓝色、绿色和红色）为边界停靠在gH上。

**图4。**
MSL-109表位内6xHis标签插入的特征。(一)结合细胞表面的MSL-109或10F8抗体的FACS图谱表达HA gH/gL或HA gH（6xHis）/gL。用携带HA gH/gL或HA gH（6xHis）/gL的质粒转染COS-7细胞年轴表示抗体与阳性细胞的结合（即APC强度），以GFP的百分比表示⁺细胞。(B类)野生型（黑圈）、W168C（蓝色方块）或6xHis（红色星号）抗-His抗体中和试验。抗体被连续稀释并与固定量的病毒混合，使得最终病毒粒子浓度为1的MOI。细胞被感染18小时，并使用带有抗CMV-IE抗体的免疫荧光进行定量。数据经过对数转换，归一化为无抗体感染，并使用Prism（GraphPad软件）绘图。

**图5。**
由TR-FRET监测的糖蛋白相互作用。(一)HSV-1 ST-gH/gL与HSV-1 ACP-gD的TR-FRET饱和曲线，或CMV ST-gH/gL与HSV-1 ACP-gD的饱和曲线。细胞与恒定量的HSV-1 ST-gH/gL或CMV ST-gH/gL和增加量的HSV 1 ACP-d.FRET和ACP和ST-proteins的表达（实验_ACP公司和Exp_装货单)进行了测量。FRET比率显示为Exp的函数_ACP公司/Exp（实验）_装货单比率。(B类和C类)CMV ST-gB与CMV ACP-gH/gL的TR-FRET饱和曲线(B类)或CMV ST-gH/gL与CMV ACP-gH/gL(C类)，如中所述一. (D类)紫外吸光度（280 nM）显示的与MSL-109 Fab（紫色）络合物中可溶性gH/gL（蓝色）和gH/gL的SEC-MALS；左侧轴）。根据峰洗脱计算出的分子量，并在相应峰上以粗线表示质量(赖特轴）。约32.5 mL时的第二个峰值测量值为47 kDa，与过量Fab一致。(E类)添加PBS（白色条）或可溶性gH/gL（黑色条）后，ST-gH/g L和ACP-gH/gL之间的FRET比率。(F类)添加PBS（白色条）、可溶性gB（灰色条）或可溶性gH/gL（黑色条）后，记录ST-gB和ACP gH/gL之间的FRET比值。中的数据E类是三个独立实验的三倍平均值±SEM。中的数据(*A–C*、和F类)是代表性实验的三倍平均值±SEM。

**图6。**
通过TR-FRET监测MSL-109结合对糖蛋白相互作用的影响。(*A–C*)添加对照IgG（白色条）或MSL-109（黑色条）后计算FRET比率。FRET测量值介于(一)ST-gB和ACP-gH/gL(B类)ST-gH/gL和ACP-gH/gL，或(C类)ST-（HCN）gH/gL和ACP-（HCN。

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1. Stagno S.巨细胞病毒。收件人：Remington JS、Klein JO、Wilson CB、Baker CJ，编辑。胎儿和新生儿的传染病。费城：WB桑德斯；2001
1. Stagno S，Whitley RJ。妊娠疱疹病毒感染。第一部分：巨细胞病毒和EB病毒感染。《N Engl J Med.1985》；313(20):1270–1274.-公共医学
1. Ross DS、Dollard SC、Victor M、Sumartojo E、Cannon MJ。先天性巨细胞病毒感染和疾病的流行病学和预防：疾病控制和预防中心工作组的活动。2006年《女性健康杂志》（Larchmt）；15(3):224–229.-公共医学
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