Mechanism of tumor rejection with doublets of CTLA-4, PD-1/PD-L1, or IDO blockade involves restored IL-2 production and proliferation of CD8(+) T cells directly within the tumor microenvironment

doi:10.1186/2051-1426-2-3

.2014年2月18日2:3:3。

doi:10.1186/2051-1426-2-3。 2014年电子收集。

CTLA-4、PD-1/PD-L1或IDO双重阻断的肿瘤排斥机制涉及肿瘤微环境中CD8（+）T细胞恢复IL-2生成和增殖

斯特凡妮·斯普朗格¹, 霍利·科布利什², 布伦丹·霍顿¹, 佩吉·A·舍尔², 罗伯特·牛顿², 托马斯·加耶夫斯基^三

附属公司

¹芝加哥大学病理学系，美国伊利诺伊州芝加哥市马里兰州南大街5841号，邮编60637。
²Incyte Corporation，Wilmington，DE 19880，美国。
^三芝加哥大学病理学系，5841 S.Maryland Ave，Chicago，IL 60637，美国；美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学医学系，邮编60637。

PMID： 24829760
预防性维修识别码：项目经理4019906
内政部： 10.1186/2051-1426-2-3

CTLA-4、PD-1/PD-L1或IDO双重阻断的肿瘤排斥机制涉及肿瘤微环境中CD8（+）T细胞恢复IL-2生成和增殖

斯特凡妮·斯普朗格等。免疫疗法癌症杂志. 2014.

.2014年2月18日2:3:3。

doi:10.1186/2051-1426-2-3。 2014年电子收集。

作者

斯特凡妮·斯普朗格¹, 霍利·科布利什², 布伦丹·霍顿¹, 佩吉·A·舍尔², 罗伯特·牛顿², 托马斯·加耶夫斯基^三

附属公司

¹芝加哥大学病理学系，美国伊利诺伊州芝加哥市马里兰州南大街5841号，邮编60637。
²Incyte Corporation，Wilmington，DE 19880，美国。
^三芝加哥大学病理学系，美国伊利诺伊州芝加哥马里兰州南大街5841号，邮编60637；美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学医学系，邮编60637。

PMID： 24829760
预防性维修识别码：项目经理4019906
内政部： 10.1186/2051-1426-2-3

摘要

背景：阻断免疫抑制途径正在成为癌症治疗的一种重要治疗方式。单药治疗在临床前模型和人类癌症患者中具有部分抗肿瘤活性。由于肿瘤微环境显示出多种免疫抑制机制同时存在的证据，因此有理由认为可能需要联合治疗才能获得最佳疗效。

方法：为了验证这一观点，我们在小鼠B16.SIY黑色素瘤模型中使用了抗CTLA-4单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体和/或IDO抑制剂INCB23843的排列。

结果：与单一治疗相比，所有三种组合都显示出显著改善的肿瘤控制，许多小鼠实现了完全的肿瘤排斥反应。这种效果是在没有接种疫苗或过继性T细胞治疗的情况下出现的。研究协同作用的机制，以检查抗肿瘤免疫反应的启动阶段与效应阶段。在肿瘤引流淋巴结（TdLN）的早期时间点，仅观察到抗肿瘤T细胞启动的轻微增加。相反，早在治疗开始后三天，在所有接受有效联合治疗的组中，肿瘤浸润性CD8（+）T细胞产生IL-2和增殖的能力均显著增加。用FTY720对小鼠进行治疗，以阻止新的T细胞从次级淋巴结构中运输，仍然能够通过肿瘤内T细胞恢复IL-2的生成和增殖，并且还保留了大部分肿瘤生长控制。

结论：我们的数据表明，这些免疫疗法的治疗效果主要是通过原位T细胞的直接再激活介导的。这三种组合对临床研究具有吸引力，肿瘤内CD8（+）T细胞产生IL-2和增殖的能力可能是整合到临床研究中的重要生物标志物。

关键词：抗-CLTA-4；联合免疫治疗；IDO抑制剂；免疫抑制途径；PD-1/PD-L1；T细胞无能/衰竭；肿瘤微环境；肿瘤滤过性淋巴细胞。

PubMed免责声明

数字

图1
**αCTLA-4、αPD-L1或IDOi阻断剂的成对组合会导致肿瘤生长迟缓。A类**.说明整个实验中给药时间点的实验设计方案。αCTLA-4于第4天、第7天、第10天静脉注射，αPD-L1于第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16天静脉注射。B类-D类.肿瘤生长量（单位：mm）²单次治疗与双次联合治疗的比较B类.αCTLA-4和αPD-L1 C.αCTLA-40和IDOiD类αPD-L1和IDOi（共3个实验）。描述了来自一个代表性实验的6只小鼠的平均+/-SEM。所有实验至少做了三次，总体结果相同。曲线旁边的数字表示所有实验的幸存者数量/小鼠总数。使用双向a-nova和Bonferroni后验测试单次治疗的显著性，如图所示，而所有治疗方案与无治疗对照组相比差异显著（***<0.0001，**<0.01）。

图2
**双方案治疗并不会导致早期外围肿瘤反应性T细胞的频率显著增加。A类**-B类.肽/K^b条对门控CD3进行五聚体染色⁺CD8（CD8）⁺T细胞，从TdLN分离**（A）**或脾脏**（B）**第7天。所示为从两个实验中收集的总共10只小鼠的平均值+/-SEM。为了进行统计分析，进行了Mann-Whitney-U检验，比较了单次治疗和双次治疗（*=0.0317αCTLA-4到脾脏中的αCTLA-4+αPD-L1）。其他治疗与无治疗对照组相比无显著差异。C类在第7天收集的脾细胞上进行IFN-γELISpot。数据显示为两个实验中10只小鼠的平均+/-SEM，无刺激作为开条，SIY特异性刺激作为填充条。Mann-Whitney-U检验用于评估不治疗组和治疗方案之间的显著差异，图中*表示与不治疗组相比存在显著差异。结果αCTLA-4与αCTLA-4+IDOi显著不同（p=0.0185），αPD-L1与αCTLA-4+αPD-Ll显著不同（p=0.0172）。

图3
**双重治疗可恢复肿瘤内淋巴细胞产生IL-2和增殖的能力。**在第7天收获肿瘤并制备单细胞悬浮液。将3-5只小鼠的细胞池合并，然后用细胞痕迹进行染色。细胞在有或无平板结合抗CD3的情况下培养48 h，然后在Brefeldin A的存在下用抗CD3/抗CD28刺激处理6 h。然后通过细胞内流式细胞术对细胞进行染色，以产生IL-2、IFN-γ和TNF-α。A类一个代表性的FACS图，显示通过细胞示踪稀释在x轴上进行增殖，并在y轴上进行细胞内IL-2染色。对五只小鼠进行了分析。B类.CD3增殖量的统计分析⁺CD8（CD8）⁺非刺激（左）组和刺激（右）组的细胞。在单向Anova测试中，与非刺激和单一治疗相比，只有双重治疗显示出显著的增殖增加。条形图表示从2个实验中收集到的总共4个池的平均+/-SEM。C类.干扰素-γ的百分比⁺（开杆），IFN-γ⁺和IL-2⁺（灰条）和增殖IFN-γ⁺白介素-2⁺计算CD3中的细胞（填充条）⁺CD8（CD8）⁺细胞数量。D类.多功能（TNF-α）的百分比⁺干扰素-γ⁺白介素-2⁺增殖）CD8⁺显示了T细胞（黑色）与其他功能较弱的亚群的比较。深灰色表示不增殖，浅灰色表示不产生IL-2，白色表示每个治疗组不产生IFN-γ。C类和D类根据中显示的结果进行计算A类和B类.

图4
**在没有新T细胞迁移的情况下恢复肿瘤浸润淋巴细胞的IL-2生成和增殖。**在开始治疗之前，用FTY720或对照载体对B16.SIY荷瘤小鼠进行治疗，以防止新淋巴细胞迁移到肿瘤中。A类在肿瘤收获当天接受FTY720治疗后的外周血T细胞数量进行分析。开条显示CD45的数量⁺CD3（CD3）⁺在200μl溶媒处理小鼠外周血中检测到的T细胞设置为100%。填充条表示FTY720处理小鼠相对于车辆处理组的数量。B类&C类用细胞痕迹标记来自肿瘤的单细胞悬浮液，并用板结合的抗CD3抗体刺激48小时，然后在Brefeldin A存在下用抗CD3和抗CD28刺激。然后通过细胞痕迹稀释分析细胞增殖，并通过细胞内染色产生IL-2。描述了增殖细胞的百分比**（B）**或增殖和IL-2生成细胞**（C）**比较车辆治疗组（开放栏）和FTY720治疗组（填充栏）。结果显示为结合两个实验的平均+/-SEM，每个实验有两个由3只小鼠组成的水池。使用Mann-Whitney-U检验检验显著性，但FTY720和溶媒对照组之间未检测到显著变化，但αPD-L1+IDOi治疗组的IL-2生成增加（p=0.02）。

图5
**尽管在以后的时间点服用FTY720，但肿瘤控制基本保持不变。**在接种肿瘤之前，用FTY720或对照载体对B16.SIY荷瘤小鼠进行治疗**（B）**，在开始治疗之前**（C）**或在第10天最后一次服用αCTLA-4单克隆抗体**（D）**.A类。实验设计的示意图概述粗体箭头表示FTY720治疗的开始，该治疗始终在整个实验中进行。B类-D类.肿瘤生长量（单位：mm）²比较未治疗（开放）与αCTLA-4+αPD-L1（填充）的溶媒对照（圆形）与FTY720治疗（方形）。B类FTY720治疗在肿瘤接种前24小时开始。C类FTY720治疗于第4天开始治疗前2.5小时进行。D类FTY720与最后一次αCTLA-4 mAb治疗的时间点相同。描述了一个具有代表性的实验，显示了5只小鼠+/-SEM的平均值。显著性通过Bonferroni后验的双向方差分析确定。

图6
**免疫治疗双重物导致CD8增加BrdU掺入**⁺**和CD4**⁺**肿瘤浸润性T细胞**体内.在体内单次BrdU脉冲后第7天、24小时采集TIL，并对细胞进行BrdU染色，同时检测抗CD3、抗CD4和抗CD8。所示为BrdU的百分比⁺CD3细胞⁺CD8（CD8）⁺**（A）**和CD3⁺CD4细胞⁺**（B）**。所示数据显示了一个实验中总共5只小鼠的平均值，并代表了两个独立实验。采用双向Anova检验并考虑脾脏和TdLN的增殖值评估差异。*除αCTLA-4对CD4 T细胞增殖的双重治疗外，所有双重治疗与相应的单一治疗均存在显著差异。

图7
**免疫治疗双重物导致肿瘤抗原特异性T细胞在周围晚些时候的频率增加。**描述了第14天采集的脾细胞的IFN-γELISpot，开条为非刺激对照，填充条表示SIY刺激。数据显示为来自两个实验的10只小鼠的平均+/-SEM。使用Mann-Whitney-U检验对所有组与未治疗组进行统计分析。所有双治疗组与各自的单治疗组均存在显著差异，当相互比较双治疗时，观察到αCTLA4+αPD-L1和αPD-L1+IDOi之间存在显著差异。

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