Unusual characteristics of the DNA binding domain of epigenetic regulatory protein MeCP2 determine its binding specificity

doi:10.1021/bi500424z

.2014年6月3日；53(21):3379-91.

doi:10.1021/bi500424z。 Epub 2014年5月23日。

表观遗传调控蛋白MeCP2 DNA结合域的异常特征决定了其结合特异性

谢尔盖·赫拉普诺夫¹, 克里斯托弗·沃伦, 郑惠永（Huiyong Cheng）, 埃丝特·贝尔科, 约翰·M·格里利, 迈克尔·布伦诺维茨

附属公司

PMID： 24828757
预防性维修识别码：项目经理4045320
内政部： 10.1021/bi500424z

表观遗传调控蛋白MeCP2 DNA结合域的异常特征决定了其结合特异性

谢尔盖·赫拉普诺夫等。生物化学. 2014.

.2014年6月3日；53(21):3379-91.

doi:10.1021/bi500424z。 Epub 2014年5月23日。

作者

谢尔盖·赫拉普诺夫¹, 克里斯托弗·沃伦, 郑惠永（Huiyong Cheng）, 埃丝特·贝尔科, 约翰·M·格里利, 迈克尔·布伦诺维茨

隶属关系

¹耶什瓦大学阿尔伯特·爱因斯坦医学院生物化学系和遗传学系，地址：1300 Morris Park Avenue，Bronx，New York 10461，United States。

PMID： 24828757
预防性维修识别码：项目经理4045320
内政部： 10.1021/bi500424z

摘要

蛋白MeCP2通过结合染色质上的甲基-CpG（mCpG）位点介导表观遗传调控。MeCP2由六个结构域组成，其中一个结构域是甲基结合结构域（MBD），它与双链DNA中的mCpG位点结合。我们表明，生理盐浓度或更高盐浓度的溶液条件或非特异性竞争DNA的存在对于MBD以高特异性区分mCpG和CpG是必要的。在这些溶液条件下，mCpG比CpG的特异性＞100倍。相反，MBD不区分羟甲基-CpG和CpG。MBD在位点特异性DNA结合蛋白中不常见，因为（i）特异性不是通过增强对特定位点的亲和力而获得的，而是通过抑制其对通用DNA的亲和力来获得的，（ii）其与mCpG的特异性结合是高度静电的，以及（iii）它在DNA结合时吸收并置换单价阳离子。MBD对单链DNA的亲和力异常高，与修饰或序列无关。此外，MBD通过非合作结合途径在DNA上形成离散二聚体。由于第二单体的亲和力比非特异性结合大1个数量级，MBD二聚体是一种独特的分子复合物。本文讨论了这些结果在神经功能和发育以及MeCP2相关发育障碍（如Rett综合征）方面的意义。

PubMed免责声明

数字

图1
等温线由荧光各向异性（ex₄₉₀和em₅₂₀)用于MBD与荧光标记的双联5′-TCTGGAAC类GGAATTCTCTA-3′具有C类对称甲基化（●）或非甲基化（○）和荧光标记双链5′-TCTGGTATAACTTCTA-3′缺乏任何MBD约束决定因素（“随机”，*）在含有25 mM Tris的标准缓冲溶液中测定，6%甘油、0.1 mM EDTA、100μg/mL BSA、0.1 mM-TCEP（pH 7.6）、，以及25（A）或150mM KCl（B）。DNA浓度为5 nM。实线表示Langmuir模型的全局拟合（表1）。

图2
等温线由荧光各向异性（ex₄₉₀和em₅₂₀)MBD与不同DNA的结合在150 mM KCl下，MBD浓度范围大于该范围如图1所示。反应条件和符号名称如图1所示。

图3
化学计量的MBD与mCpG结合的滴定寡核苷酸双链与DNA偶联探针的各向异性标准缓冲液和150 mM KCl。总DNA浓度为0.5μM，使用5 nM标记DNA作为示踪剂。

图4
荧光素末端标记mCpG的沉降平衡分析寡核苷酸（低）和1:1（中）和2:1（上）摩尔比MBD:mCpG寡核苷酸-F的490 nm吸光度标签。实线是对单个模型的全局拟合单分散颗粒。每个通道的拟合残差浓度分布如下所示。

图5
结合等温线将MBD转化为标准中的甲基化DNA根据荧光各向异性（例如₄₉₀和em₅₂₀)适合两个站点（-）或实验中描述的单场地（---）模型程序。底部面板表示残差关于拟合模型[双场地（●）和单场地(∗)]. 所分析的DNA双链与图1中的相同。插图显示了在1μM处截断的相同数据它们独立地适合于单站点模型。

图6
MBD与甲基化（A），非甲基化（B），以及在25 mM KCl的标准缓冲液中获得的随机（C）DNA由荧光各向异性（ex₄₉₀和em₅₂₀). 等温线适合于双位点（-）或实验中描述的单场地（---）模型程序。底部面板显示了有关的残差拟合模型[双点（●）和单点（*）]。

图7
（A）荧光各向异性测定的等温线（例如₄₉₀和em₅₂₀)MBD与mCpG的结合（●），150 mM KCl和10的标准缓冲液中的CpG（○）和随机序列（*）寡核苷酸（图1图例）μg/mL聚（dA-dT）竞争对手。（B）结合等温线标准缓冲液中单链寡核苷酸的MBD25 mM KCl（在面板A中指定）或150 mM KCl（◑）下的mCpG。不存在竞争对手DNA。实线表示最佳拟合两个面板中的Langmuir绑定模型。

图8
平衡解离常数(*K（K）*_d日，微摩尔）已确定在标准缓冲液和100 mM KCl中指定对称或不对称修饰的DNA双工体mCpG（甲基化）、CpG-（非甲基化）和hmCpG--（5-羟甲基化）。

图9
（A） Wyman联动装置MBD与mCpG轴承的结合分析（●，-）、CpG-轴承（○，---）和随机序列标准缓冲液中的（*，-·−）寡核苷酸作为KCl浓度的函数。关联的每个值常数(*K（K）*_一)由绑定确定获得了如图1所示的等温线在指示的KCl浓度下。（B）盐诱导解离MBD和mCpG、CpG和随机序列配合物的等温线标准缓冲液中的寡核苷酸与KCl浓度的关系。MBD的固有色氨酸荧光₂₈₀和em₃₃₀)按照实验程序进行监测。这些线描述了等式9和10的拟合（表3）。所有名称与面板A中的相同。

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