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.2014年5月5日；10(5):728.
doi:10.1002/msb.20134892。

向谷氨酰胺的代谢转变调节卵巢癌的肿瘤生长、侵袭和生物能量学

杨丽峰 1, 泰勒·莫斯, Lingegowda S Mangala公司, 胡安·马里尼, 赵红云, 斯蒂芬·瓦利格, 吉列尔莫·阿马里兹·佩纳, 大海江, 阿比纳夫·阿克里亚, 朱莉娅·温, 拉杰沙·鲁帕伊莫尔, 克里斯蒂安·罗德里格斯-阿瓜约, 伊梅尔达·梅尔卡多·乌里布, 加布里埃尔·洛佩斯·贝雷斯坦, 刘劲松, 冢本隆, 阿尼尔·K·苏德, 普拉拉德·T·拉姆, 迪帕克·纳格拉思
附属公司

向谷氨酰胺的代谢转变调节卵巢癌的肿瘤生长、侵袭和生物能量学

杨丽峰等。 分子系统生物. .

摘要

谷氨酰胺在多种癌症的细胞生长中起着关键作用。谷氨酰胺依赖性癌细胞依赖谷氨酰胺维持生存，其代谢被重新编程，以通过三羧酸（TCA）循环利用谷氨酰胺。在这里，我们发现了癌症侵袭性和谷氨酰胺依赖性之间缺失的联系。使用同位素示踪剂和生物能量分析，我们发现低侵袭性卵巢癌（OVCA）细胞是谷氨酰胺非依赖性的，而高侵袭性卵巢癌细胞明显是谷氨酰胺依赖性的。与我们的研究结果一致，OVCA患者的微阵列数据表明，谷氨酰胺水解与低存活率相关。值得注意的是，与谷氨酰胺合成代谢和分解代谢相关的基因表达比率已成为患者预后的新生物标志物。值得注意的是，我们发现谷氨酰胺调节STAT3的激活，STAT3是调节侵袭性OVCA细胞中癌症标志物的信号通路介质。我们的研究结果表明，通过阻断谷氨酰胺进入TCA循环来靶向高侵袭性OVCA细胞，以及通过抑制谷氨酰胺合成和STAT3靶向低侵袭性OVC细胞的联合方法可能会导致潜在的治疗OVCA的方法。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。谷氨酰胺成瘾与卵巢癌细胞侵袭性呈正相关(OVCA公司)

  1. 谷氨酰胺剥夺对一组细胞增殖率的影响OVCA公司24、48和72小时。OVCAR公司三，IGROV型1,OVCA公司429个细胞G公司独立；OVCA公司420和OVCAR公司8个细胞为中度G公司ln依赖；和SKOV公司三，SKOV公司3ip和H（H）ey 8细胞G公司不依赖。n个 ≥ 15.

  2. 葡萄糖剥夺对细胞增殖率的影响OVCA公司细胞系24、48、72小时。n个 ≥ 15.

  3. 谷氨酰胺剥夺对克隆形成的影响IGROV型1和SKOV公司三。n个 = 6.

  4. Matrigel侵袭试验用于表征奥夫卡细胞系。OVCAR公司三，IGROV型1和OVCA公司429个细胞是非侵袭性的，OVCA公司420和奥夫卡8个细胞中度侵袭，而SKOV公司三，SKOV公司3ip和Hey 8具有高度侵袭性OVCA公司细胞系。n个 ≥ 6.

  5. 72小时增殖率之间的相关性OVCA公司Gln缺乏条件下的细胞系及其相应数量的入侵细胞。

  6. 与生长速度相关的细胞周期蛋白的Western blot分析(疾病预防控制中心2、细胞周期蛋白D类1） 和与转移潜能相关的蛋白质(E类钙粘蛋白）OVCA公司细胞系。β-actin作为负荷控制。

  7. 谷氨酸分解和三羧酸循环代谢途径中的基因与高风险OVCA公司患者。图中所示为代谢网络和产生酶催化网络中反应的基因（矩形）。网络中的基因通过与OVCA公司基于计算患者生存率C类ox危害值（颜色键）。基因表达和临床数据用Cox比例风险模型进行拟合，以确定每个基因在G公司ln/葡萄糖代谢网络。在催化反应的基因产物中观察到较高的危险比（不良结果）G公司ln分解代谢和糖酵解基因的高表达最终使患者存活率提高（低风险比）。

数据信息：（A–D）中的数据表示为平均值±扫描电镜, *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对<0.001。在（D）中，单向方差分析使用Tukey的测试对细胞系进行比较，使用OVCAR公司3作为对照。
图2
图2。谷氨酰胺驱动的三羧酸(TCA公司)高侵袭性卵巢癌的循环代谢物丰度、还原羧基化和氧化磷酸化显著高于低侵袭性卵巢肿瘤(OVCA公司)单元格
  1. A类

    使用1:1混合物的碳原子跃迁示意图13C类6葡萄糖和1-13C标记葡萄糖。这允许估计葡萄糖对TCA公司谷氨酸和谷氨酰胺的循环代谢产物和合成。黑色表示1上标记的碳标准 TCA公司循环，黄色代表2上标记的碳第 TCA公司循环，蓝色代表3上标记的碳第个 TCA公司循环。

  2. B–D类

    葡萄糖对TCA公司代谢产物和谷氨酸池。质量同位素分布的比较(中间)苹果酸（B）、富马酸（C）、谷氨酸（D）的高侵袭性(SKOV公司3） 和低侵袭性(OVCAR公司3） 用1:1混合物培养的细胞13C类6葡萄糖和1-13C标记葡萄糖。

  3. E类

    碳原子跃迁示意图13C类5标记为Gln。黑色代表Gln进入TCA循环之前的标记碳。绿色表示Gln对正则函数的直接影响TCA公司循环，红色表示Gln对TCA公司通过还原羧基化循环。

  4. 如果

    Gln对TCA公司循环代谢产物库。的比较中间属于M（M）5谷氨酸，M（M）富马酸4，M（M）4苹果酸，M（M）4柠檬酸OVCAR公司3和斯科夫3种培养基13C类5‐标记G公司自然对数。

  5. G公司

    还原羧基化相关同位素的质量同位素分析。M5柠檬酸盐，M（M）3苹果酸，M（M）3富马酸盐和M（M）3天冬氨酸分析表明高侵袭性的还原羧基化通量显著高于低侵袭性OVCA公司细胞。

  6. H（H）

    基本耗氧量(光学字符识别)和细胞外酸化率(ECAR公司)测量了OVCAR公司三，OVCA公司420,SKOV公司3和SKOV公司3ip细胞系。基础光学字符识别是对牛津大学活性和基础ECAR公司是对糖酵解活性的测量。

  7. 我

    使用寡霉素，催化裂化装置和抗霉素，我们估计了OVCA公司细胞通过最大和储备线粒体容量。

  8. J型

    使用2DG公司，我们估计了奥夫卡细胞通过最大和储备的糖酵解能力。

  9. K（K）

    百分比牛津大学糖酵解对癌细胞能量需求的贡献。

  10. L（左）

    相对代谢物丰度使用GC公司‐微软在里面OVCAR公司3和SKOV公司3个细胞。

  11. M（M）

    参与谷氨酰胺水解的氨基酸的细胞外吸收/分泌通量（谷氨酰胺：G公司自然对数；谷氨酸：G公司鲁；丙氨酸：丙氨酸；天冬氨酸盐：A类sp）用超高效液相色谱法测定。

数据信息：数据表示为平均值±扫描电镜,n个 ≥ 9, *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001. 在（I）和（J）中，单向方差分析使用Tukey的测试对细胞系进行比较，使用OVCAR公司3作为对照。
图3
图3。谷氨酰胺在高侵袭性卵巢癌中具有积极调节呼吸和选择性维持氧化还原平衡的多效性作用(OVCA公司)单元格

  1. 氧气消耗率(光学字符识别)被测量为高侵袭性(SKOV公司3和SKOV公司3ip），低侵袭性(IGROV型1和OVCAR公司3） 和中度侵入性(奥夫卡420）含有Gln、氨基氧乙酸盐的培养基中的细胞(AOA公司)和α‐酮戊二酸（α‐千克).光学字符识别用注射前的值进行标准化。

  2. 扩散分析OVCA公司浓度范围为6‐重氮‐5‐氧‐L‐去甲亮氨酸（L‐大学教师)，一种Gln类似物，可抑制G公司ln转化为谷氨酸。数据在完全介质条件下进行标准化L（左）‐大学教师.

  3. 扩散分析OVCA公司表没食子儿茶素没食子酸盐浓度范围的细胞系(EGCG公司谷氨酸脱氢酶抑制剂，将谷氨酸转化为α‐千克)用于抑制谷氨酸进入三羧酸(TCA公司)循环。α‐千克用于挽救细胞增殖减少EGCG公司数据在完全介质条件下进行标准化EGCG公司.

  4. 扩散分析OVCA公司当谷氨酰胺水解被浓度范围内的AOA公司数据在完全介质条件下进行标准化AOA公司.

  5. 葡萄糖通过直接糖酵解或通过磷酸戊糖氧化途径生成乳酸和柠檬酸(购买力平价)和糖酵解。黑色圆圈代表标记的碳，空圆圈代表未标记的碳。粉色圆圈代表氧化PPP中的未标记碳。

  6. 谷氨酰胺水解生成乳酸和柠檬酸。蓝色圆圈表示苹果酶中标记的碳，绿色圆圈表示标准碳TCA公司循环。

  7. 葡萄糖剥夺对乳酸分泌率的影响。

  8. 的比较M（M）3丙酮酸和M（M）3从葡萄糖中提取的乳酸（以下物质的1:1混合物U型‐13C类6葡萄糖和1-13C类1葡萄糖）或G公司在(U型‐13C类5 G公司ln）高侵袭性和低侵袭性OVCA公司细胞。由于所有条件都有完整的培养基，因此它们的总丙酮酸和乳酸含量应该相同。

  9. 的比较M（M）来自葡萄糖的2柠檬酸盐标记和来自Gln-in的M6柠檬酸盐标记奥夫卡3和SKOV公司3个单元格。在所有条件下，丙酮酸和乳酸的总含量应等于（H）中所述的值。

  10. 使用数学关系（未标记的M0乳酸百分比-标记的M（M）1乳酸）表示相对氧化购买力平价通量OVCAR公司3和SKOV公司用1:1的混合物培养3个细胞13C类6葡萄糖和1-13C标记葡萄糖。

  11. 的角色G公司ln维持线粒体膜电位(基质金属蛋白酶)低侵袭性和高侵袭性细胞中的水平。

  12. Gln保持列车自动防护系统高侵袭性的选择性内容OVCA公司细胞。

  13. Gln减少由H（H）2O（运行）2在高侵袭细胞中，但在低侵袭细胞中没有。

  14. Gln保持NADPH公司高侵袭性水平OVCA公司细胞。

  15. Gln增加的比率NADPH公司/总计NADPH公司高侵袭性的选择性比率OVCA公司细胞。在高侵袭性疾病中，葡萄糖无法提供足够的还原当量OVCA公司细胞。

  16. 谷氨酰胺/葡萄糖剥夺对癌细胞中总谷胱甘肽和还原性谷胱甘苷水平的影响。

数据信息：（A–N）中的数据表示为平均值±扫描电镜,n个 ≥ 9, **对 < 0.01, ***对 < 0.001. 数据输入（O，P）(n个≥6）表示为平均值±扫描电镜, *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001.
图4
图4。谷氨酰胺分解代谢与合成代谢的比例调节可降低致瘤性
  1. A类

    基因表达水平G公司在合成酶中(GLUL公司)和谷氨酰胺酶(GLS1级)使用卵巢癌细胞系基因表达数据库KyotoOv38进行测定。

  2. B类

    蛋白质印迹GLUL公司和GLS公司1个蛋白质表达水平OVCA公司细胞系。

  3. C–E类

    无进展生存率OVCA公司患者，根据GLS公司1/GLUL公司（C） ，GLUD公司1/GLUL公司（D） (GLS公司1 + GLUD公司1)/GLUL公司（E） ●●●●。生存分析是通过比较上四分位和下四分位患者进行的。（总患者n个 = 539).

  4. F、 G公司

    转换独立于GlnOVCA公司将葡萄糖替换为半乳糖（F）或低葡萄糖浓度（L葡萄糖）和2‐DG公司（10mM）（G）。

  5. H（H）

    半乳糖和低血糖对耗氧量的影响(光学字符识别)/细胞外酸化率。

  6. 我

    靶向高侵袭性的联合方法OVCA公司通过阻断谷氨酰胺进入细胞TCA公司以低侵袭性为目标OVCA公司细胞通过抑制谷氨酰胺合成导致细胞生长显著减少。瞄准GLUL公司使用MSO公司Gln剥夺减少OVCA公司细胞生长。任意单位(澳大利亚)与电池数量成正比(n个 ≥ 10).

图5
图5。谷氨酰胺酶活性是高侵袭性卵巢癌肿瘤生长和侵袭所必需的(OVCA公司s）
  1. A类

    上皮性疾病患者疾病特异性生存期的卡普兰-迈耶曲线OVCA公司(n个=139）基于GLS公司1和G公司ln合成酶蛋白表达。使用对数秩检验（双侧）比较各组之间的差异。

  2. B类

    转染后GLS公司1硅核糖核酸或控制si核糖核酸,信使核糖核酸水平评估采用qRT（定量放射治疗）‐聚合酶链反应.

  3. C–H型

    硅的治疗效果核糖核酸调解GLS公司下调：（C）肿瘤结节（D）体积（E）低侵袭侵袭模式OVCA公司细胞系(IGROV型1); （F） 肿瘤结节（G）体积和（H）侵袭模式斯科夫裸鼠模型中的3ip1细胞。裸鼠皮下注射2.0×106 IGROV型1或SKOV公司3ip1细胞，小鼠随机分为以下组之一：对照组核糖核酸‐DOPC公司或GLS公司1硅核糖核酸‐DOPC公司肿瘤细胞注射后3天开始治疗核糖核酸脂质体每周给药两次，剂量为150μg/kg体重，持续2周。在处死时，记录小鼠体重、肿瘤重量和肿瘤体积。Student’s对肿瘤重量进行了统计分析t吨‐测试**对=0.007和**对=0.008，与对照si相比核糖核酸‐DOPC公司.

图6
图6。谷氨酰胺通过调节高侵袭性细胞的致癌转化斯达3个活动

  1. 的比较OVCAR公司3侵入能力G公司在耗尽和完全介质条件下。入侵能力SKOV公司3在完全培养基、去谷氨酰胺培养基和药物抑制培养基下测量G公司ln进入三羧酸(TCA公司)循环。L‐大学教师,BPTES公司,EGCG公司,AOA公司鱼藤酮减少SKOV公司3的Matrigel侵入能力。α‐酮戊二酸酯（α‐千克)谷氨酰胺缺乏时添加或EGCG公司条件救援SKOV公司3的侵入能力。数据以平均值±SEM表示*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001,n个 ≥ 4.

  2. 通过酪氨酸-705磷酸化激活Stat3（Stat3。第页705）在高侵袭性卵巢癌中升高(OVCA公司)单元格。磷酸化水平表皮生长因子受体和E类rk1/2随着入侵程度的增加而增加。酪氨酸激酶信号通路的活性会受到代谢应激和谷氨酰胺和葡萄糖缺乏的高侵袭性细胞的影响。统计数据3。第页705随着Jak总水平的降低而降低。统计数据3。第页705级仅在OVCA公司420个细胞株在葡萄糖剥夺后S公司在低侵袭性细胞系中，代谢应激导致的tat3磷酸化缺失，OVCAR公司3.Stat3丝氨酸‐727磷酸化(S公司表3。pS公司727）也随着磷酸化水平的降低E类rk1/2在高侵袭性细胞系中仅对谷氨酰胺缺乏反应。β肌动蛋白作为负载对照。

  3. 高侵袭性细胞增殖OVCA公司当谷氨酰胺缺乏时，细胞系减少。通过过度表达转基因Stat3和Stat3、Stat3c的组成活性突变体（平均值±标准偏差,n个 = 3, *对 < 0.05. β‐肌动蛋白作为负荷控制。

  4. α‐千克额外救援斯达3酪氨酸磷酸化和Jak1，但不能拯救Stat3丝氨酸727磷酸化。β肌动蛋白作为负载对照。Western blot图是从同一凝胶上切下的，但在第一列中重新排列了通道以显示完整的培养基条件，在第二列和α-千克在第三列中添加。凝胶的完整Western blot图像和详细描述包含在源文件中。

  5. 办公自动化额外救援斯达3酪氨酸磷酸化。β‐肌动蛋白作为负荷控制。蛋白质印迹图是从同一凝胶上切下的，但泳道被重新排列，只包括相关条件。凝胶的完整Western blot图像和详细描述包含在源文件中。

  6. BPTES公司和鱼藤酮抑制斯达酪氨酸705处的3磷酸化(Y（Y）705). β‐肌动蛋白作为负荷控制。Western blot图是从同一凝胶上切下的，但通道的排列仅显示相关条件。凝胶的完整Western blot图像和详细描述包含在源文件中。

  7. Stat3抑制降低OVCA公司转移。治疗SKOV公司3个单元格AG公司490导致侵袭减少。

  8. 靶基因的表达水平斯达使用KyotoOv38在五分之三的患者中确定参与入侵OVCA公司细胞。高侵袭性OVCA公司细胞具有较高的侵袭基因表达。

  9. 添加AG公司490，Stat3抑制剂增强葡萄糖和谷氨酰胺缺乏对细胞增殖的影响OVCA公司细胞系。

  10. 添加stattic、抑制剂斯达对两种细胞株都有联合细胞毒作用。

数据信息：（I）和（J）中的数据表示为平均值±扫描电镜,n个 ≥ 8, *对 < 0.05, **对<0.01***对<0.001。可在线获取此图的源数据。
图7
图7。谷氨酰胺对高侵袭性卵巢癌代谢重构的影响(奥夫卡)单元格已通过斯达3磷酸化
  1. A、 B类

    谷氨酰胺剥夺对小鼠葡萄糖摄取（A）和乳酸分泌（B）通量的影响OVCAR公司三，OVCA公司420,SKOV公司三，SKOV公司3ip单元。

  2. C、 D类

    的影响AOA公司，α‐酮戊二酸（α‐千克)葡萄糖摄取（C）和乳酸分泌（D）通量OVCA公司细胞。

  3. E、 F类

    葡萄糖剥夺对高侵袭性（F）和低侵袭性（E）患者谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸摄取/分泌通量的影响OVCA公司细胞。

  4. G公司

    AG公司490对酪氨酸和丝氨酸磷酸化的影响斯达低侵袭性3例(奥夫卡3） 和高侵袭性(SKOV公司3)OVCA公司细胞。

  5. H（H）

    AG公司490转移低侵袭性OVCA公司细胞从糖酵解到牛津大学而对于高侵袭性细胞则相反。

  6. 我

    AG公司490增加耗氧量(光学字符识别)对于奥夫卡3并减少光学字符识别对于SKOV公司3个单元格。

  7. J型

    AG公司490降低细胞外酸化率(ECAR公司)对于OVCAR公司3并增加ECAR公司对于SKOV公司3个细胞。

  8. K、 L（左）

    AG公司490降低葡萄糖摄取（K）和乳酸分泌率（L）OVCAR公司3和增加葡萄糖摄取和乳酸分泌率SKOV公司三。

数据信息：（A–D）中的数据表示为平均值±扫描电镜,n个 ≥ 9. ***对 < 0.001. （E，F）中的数据表示为平均值±扫描电镜,n个 = 6. *对 < 0.05, **对 < 0.01. （H–L）中的数据表示为平均值±扫描电镜,n个 ≥ 6, ***对 < 0.001.
图8
图8。谷氨酰胺进入三羧酸(TCA公司)周期调节卵巢癌(OVCA公司)侵略性
显示营养利用变化的示意图TCA公司随着入侵程度的增加而循环。低侵袭性OVCA公司细胞对葡萄糖有依赖性TCA公司循环池。随着癌细胞侵袭性的增强TCA公司循环从葡萄糖转移到谷氨酰胺。高侵袭性OVCA公司细胞，Gln主导TCA公司循环。低侵袭性OVCA公司细胞，葡萄糖激活J型ak1，激活斯达3通过酪氨酸磷酸化，从而调节癌细胞中的糖酵解。高侵袭性OVCA公司细胞，除了葡萄糖在激活中的作用斯达3酪氨酸磷酸化，谷氨酰胺激活JAK公司1到TCA公司循环以进一步激活斯达3通过酪氨酸磷酸化从而调节糖酵解。此外，Gln激活Erk1/2，Erk1/2随后激活斯达3通过丝氨酸磷酸化选择性地在高侵袭性OVCA公司细胞。丝氨酸磷酸化斯达3通过与线粒体复合物I和二，从而增加TCA公司高侵袭性的周期活动OVCA公司细胞。
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