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.2014年9月15日：41:120-30。
doi:10.1016/j.niox.2014.04.008。 Epub 2014年4月19日。

AP39是一种新型线粒体靶向硫化氢供体，刺激细胞生物能量学，发挥细胞保护作用，防止体外氧化应激内皮细胞线粒体DNA完整性的丧失

巴托斯·什琴斯尼 1, 卡塔林·莫迪斯 1, 川崎（Kazunori Yanagi） 1, 西罗·科莱塔 1, 索菲·勒·特里昂内尔 2, 亚历克西斯·佩里 三, Mark E Wood公司 三, 马修·怀特曼 4, 萨巴·萨博 5
附属公司

AP39是一种新型线粒体靶向硫化氢供体，刺激细胞生物能量学，发挥细胞保护作用，防止体外氧化应激内皮细胞线粒体DNA完整性的丧失

巴托斯·什琴斯尼等。 一氧化氮. .

摘要

本研究的目的是研究最近合成的线粒体靶向H2S供体AP39[（10-oxo-10-（4-（3-硫氧基-3H-1,2-二巯基-5yl）苯氧基）癸基）三苯基溴化鏻]对bEnd.3小鼠微血管内皮细胞体外生物能量学、存活率和线粒体DNA完整性的影响，在正常条件下和氧化应激期间。用荧光染料7-叠氮-4-甲基香豆素评估细胞内H2S。为了测量生物能量功能，使用XF24细胞外通量分析仪。通过MTT和LDH方法联合评估细胞活力。氧化蛋白修饰用Oxyblot法测定。活性氧生成通过MitoSOX方法进行监测。采用长扩增子PCR方法检测线粒体和核DNA完整性。氧化应激是由葡萄糖氧化酶引起的。将AP39（30-300 nM）添加到bEnd.3细胞中会增加细胞内H2S水平，在线粒体区域具有优先反应。AP39对线粒体活性产生浓度依赖性影响，包括在低浓度（30-100 nM）下刺激线粒体电子传递和细胞生物能量功能，在高浓度（300 nM）时抑制作用。在葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激条件下，发现氧化蛋白修饰增加，线粒体氧化增强，细胞生物能量功能受到抑制，细胞活力降低。AP39预处理减弱了这些反应。葡萄糖氧化酶诱导线粒体DNA优先损伤；AP39（100 nM）预处理对其有保护作用。总之，当前论文记录了AP39在氧化应激条件下的抗氧化和细胞保护作用，包括对线粒体DNA氧化损伤的保护。

关键词：生物能量学；细胞保护；DNA修复；线粒体；氧化应激。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明

MW、MEW和AP已于2012年10月1日就AP39 WO2013045951申请专利保护。

数字

图1
图1。AP39及其两个控制分子AP219和ADT-OH的化学结构
AP219是一种类似AP39的脚手架，没有H2如果化合物被胞内酯酶水解，则为AP39的预测产物。ADT-OH是H2AP39中使用的S供体部分，没有线粒体靶向的TPP+小组。
图2
图2。AP39生成H2S主要存在于线粒体中
（A）用不同浓度的AP39（如图所示）处理内皮细胞（bEnd.3）1小时，细胞内H2使用材料和方法中描述的AzMC荧光探针检测S。线粒体定位由MitoTracker Red监测。注意H的浓度依赖性增加2S信号对AP39治疗的反应，AP39治疗至少部分位于线粒体区域内。（B）线粒体H缺乏增加2线粒体解偶联剂FCCP预处理细胞时，S信号对AP39的反应。（C）H缺乏增加2AP219的S荧光和线粒体H缺乏增加2ADT-OH的S荧光。这些数字代表了针对每个终点重复进行的三个独立实验。
图3
图3。AP39对静息细胞生物能量学的影响
内皮细胞（bEnd.3）与不同浓度的AP39孵育1小时，并使用《材料和方法》中描述的细胞外通量分析仪测定生物能量学参数。零件（A）显示代表性轨迹；部分（B）显示计算出的生物能量参数。*与对照组（无AP39）相比，**显示生物能量参数显著增强（分别为p<0.05和p<0.01）；#与对照组相比，显示出对生物能量参数的显著抑制（p<0.05）。第（B）部分显示的结果显示了三个独立实验的平均±SEM值，每个终点有5个重复。
图4
图4。H的生成2哦2培养基中的葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶和H引起DCF荧光增强的比较2哦2在组织培养基中培养1小时后。该图显示了重复进行的三个独立实验的平均±SEM值。
图5
图5。AP39对氧化应激细胞的保护作用
(A类)bEnd.3内皮细胞中葡萄糖氧化酶暴露后不同时间点MTT降低的时间进程。将细胞暴露于葡萄糖氧化酶（0.01或0.03 U/ml）中1h，然后冲洗并用新鲜组织培养基替换培养基。随后培养细胞23小时，然后测量MTT转化率。（B）根据24小时的测量结果，AP219或ADT-OH（100 nM）对bEnd.3内皮细胞MTT降低无影响。（C）AP219或ADT-OH（100 nM）对葡萄糖氧化酶诱导的MTT减少减少缺乏保护作用，如24小时在bEnd.3内皮细胞中测得的。（D）AP39（30–300 nM）对MTT转化为formazan的线粒体缺乏影响，formazan是bEnd.3内皮细胞24小时线粒体功能/细胞活力的指标。请注意，AP39本身并不影响MTT转换。(电子)不同浓度的AP39对暴露于由葡萄糖氧化酶（GOx）浓度升高引起的不同浓度氧化应激的细胞中MTT转化的影响。注意，GOx处理细胞的MTT转化率降低；AP39减弱了这些影响。还请注意，AP39介导的保护作用仅在GOx的中等浓度下观察到；在所用GOx的最高浓度（0.1–0.3 U/ml）下，不再观察到保护作用。(F类)AP39对质膜完整性破坏的影响，通过LDH释放到细胞外介质进行测量。请注意，中等浓度的AP39可减弱未经氧化剂处理的细胞的基础LDH释放，这可能表明活性提高或保护细胞免受轻微的基线细胞功能障碍/细胞死亡。(G公司)AP39对不同浓度GOx暴露细胞LDH释放的影响。请注意，AP39减少了中等浓度GOx时LDH的释放；在所用GOx的最高浓度（0.3 U/ml）下，不再观察到保护作用。*与基线对照组（在没有GOx或AP39的情况下）相比，经GOx治疗后，MTT显著降低，LDH显著增加与相同浓度GOx或不含GOx的相应对照组相比，p<0.05表明AP39显著提高MTT或显著降低LDH。第A-G部分显示的结果显示了三个独立实验的平均值±SEM值，每个终点重复4-8次。
图6
图6。AP39对氧化应激诱导的细胞生物能量损失的保护作用
(A类)内皮细胞（bEnd.3）与100 nM AP39、0.3 U/ml GOx或其组合孵育1小时，并使用细胞外通量分析测定生物能量学参数。面板中显示了各种计算的生物能量学参数（B）请注意，与图3所示结果类似，100 nM AP39增加了基础呼吸、最大呼吸和剩余呼吸能力。氧化应激显著降低了生物能量参数。用AP39处理氧化应激内皮细胞可部分减弱维持的基础呼吸和最大呼吸，但不会影响GOx对其他评估的生物能量参数的不利影响。*与对照组（无AP39）相比，**显示生物能量参数显著增强（分别为p<0.05和p<0.01）；#与对照组相比，显示出对生物能量参数的显著抑制（p<0.05）。结果显示了三个独立实验的平均±SEM值，每个终点有5个重复。
图7
图7。AP39保护线粒体DNA免受氧化损伤
将bEnd.3细胞暴露于两种不同浓度的葡萄糖氧化酶（如图所示），在有或无100 nM AP39的情况下暴露1小时。DNA完整性（A）线粒体和（B）使用长DNA片段的PCR估计核基因组。注意，100nM的AP39不会降低线粒体或核DNA的完整性。本研究中使用的GOx浓度仅以剂量依赖的方式诱导线粒体DNA完整性降低。AP39显著保护线粒体DNA免受GOx攻击。*与GOx处理的样品相比，**显示线粒体DNA完整性显著增强（分别为p<0.05和p<0.01）。结果显示了两个独立实验的平均±SEM值，每个终点进行三次实验。
图8
图8。AP39降低葡萄糖氧化酶作用下内皮细胞的氧化应激
（A）在bEnd.3细胞的总细胞提取物或线粒体制剂中测定AP39对0.03U/ml GOx诱导的氧化羰基水平的影响（氧印迹法）。注意，氧化羰基化反应随着GOx的增加而增加，这在AP39处理的样品中减弱*与基线对照组相比，蛋白质氧化显著增加；p<0.05。（B）AP39对MitoSOX荧光水平的影响。注意AP39处理细胞中超氧物生成的浓度依赖性减少。结果显示了两个独立实验的平均±SEM值，每个终点进行三次实验。
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