Tis21 is required for adult neurogenesis in the subventricular zone and for olfactory behavior regulating cyclins, BMP4, Hes1/5 and Ids

doi:10.3389/fncel.2014.00098

.2014年4月7日8:98。

doi:10.3389/fncel.2014.00098。 2014年电子收集。

Tis21是室下区成年神经发生和嗅觉行为调节细胞周期蛋白、BMP4、Hes1/5和Ids所必需的

附属公司

¹意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所。
²意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所；意大利罗马萨皮恩扎大学心理系和“丹尼尔·博韦”中心。
^三意大利罗马EBRI基金会国家研究委员会转化药理学研究所。
⁴意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所；意大利罗马自由大学。

PMID： 24744701
预防性维修识别码：第977348页
内政部： 10.3389/传真：2014.00098

Tis21是室下区成年神经发生和嗅觉行为调节细胞周期蛋白、BMP4、Hes1/5和Ids所必需的

斯特凡诺·法里奥利·维奇奥利等。前细胞神经科学. 2014.

.2014年4月7日8:98。

doi:10.3389/fncel.2014.00098。 2014年电子收集。

附属公司

¹意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所。
²意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所；意大利罗马萨皮恩扎大学心理系和“丹尼尔·博韦”中心。
^三意大利罗马欧洲复兴开发银行基金会国家研究委员会转化药理学研究所。
⁴意大利罗马圣卢西亚基金会国家研究委员会细胞生物学和神经生物学研究所；意大利罗马自由大学。

PMID： 24744701
预防性维修识别码：项目经理3977348
内政部： 10.3389/传真：2014.00098

摘要

骨形态发生蛋白（BMP）和Notch通路调节心室下区（SVZ）干细胞的静止和自我更新，SVZ是一个成人神经源性生态位。在这里，我们分析了Tis21（Btg2/PC3）在这些通路交叉处的作用，Tis21是一种调节成年SVZ干细胞和祖细胞增殖和分化的基因。在Tis21-null SVZ和培养的神经球中，我们观察到BMP4及其效应器Smad1/8的表达强烈下降，而Notch抗神经介质Hes1/5和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）抑制剂Id1-3增加。神经前体bHLH基因NeuroD1的表达持续下降。此外，细胞周期蛋白D1/2、A2和E也显著上调。因此，在SVZ中，Tis21激活BMP通路并抑制Notch通路和细胞周期。相应地，Tis21-null SVZ干细胞显著增加；然而，增殖神经母细胞减少，而有丝分裂后的神经母细胞在SVZ中反常地积聚，未能沿着吻侧迁移流迁移到嗅球。然而，成神经细胞从SVZ外植体迁移的能力没有受到影响，这表明Tis21-null成神经细胞不会迁移到嗅球，因为末端分化有缺陷。值得注意的是，BMP4添加或Id3沉默挽救了在Tis21缺失神经球中观察到的分化缺陷，表明它们介导Tis21促分化作用。Tis21-null嗅球中颗粒神经元数量的减少导致嗅觉检测阈值的缺陷，但对嗅觉记忆没有影响，这也表明在嗅觉回路中，新的颗粒神经元在气味敏感性而非记忆中起主要作用。

关键词：Btg2；Hes1/5；Id3；成人神经发生；骨形态发生蛋白；嗅觉记忆；干细胞；心室下区。

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数字

图1
**BMP、Notch和细胞周期信号成分在SVZ和成年野生型和野生型神经球中的表达*这21*击倒老鼠。（A）** 现场P60的SVZ冠状切片杂交*这21*-空白和野生型小鼠*第21页，BMP4*，下游目标Id3槽口效应器*Hes5、bHLH基因Mash1和细胞周期蛋白D1*.比例尺200μm。（B） P60小鼠SVZ神经干细胞神经球培养物的实时PCR分析；剥夺*这21*导致抑制*骨形态发生蛋白4*、Smad和*神经D1*mRNA和Ids表达增加，*赫斯1/5*和细胞周期蛋白mRNA。平均±SEM值来自至少三个独立实验，显示为相对于对照样品（来自野生型小鼠）的折叠变化，该样品设置为单位。TATA-结合蛋白mRNA作为内源性对照进行正常化*第页< 0.05, **第页0.01，或***第页<0.001与。*这21*+/+SVZ；学生的t测验。

图2
**成人SVZ分裂干细胞增多，分化成神经细胞减少*这21*击倒老鼠。（A）**P60中SVZ冠状断面的典型共焦图像*这21*⁺^/⁺和*这21*^-^/^-小鼠，显示分裂的B干细胞，鉴定为双标记BrdU⁺/GFAP公司⁺细胞（分别为红色和蓝色）和A神经母细胞，鉴定为双标记BrdU⁺/DCX公司⁺单元格（分别为红色和绿色）。右侧是白色方框中显示的SVZ背侧和外侧区域的高倍图像。比例尺，200μm和50μm（放大）。**（B）**治疗方案，在分析前2小时进行一次BrdU注射。**（C）**分裂B干细胞（BrdU）的P60小鼠每SVZ区域数量的量化⁺/GFAP公司⁺)神经母细胞（BrdU）⁺/DCX公司⁺)和总计B（GFAP⁺)和A（DCX⁺)细胞以及总分裂细胞（BrdU⁺). 在P60时，相对于野生型，B细胞强烈增加，而A神经母细胞减少。细胞数量是每组三只动物分析的平均值±SEM*第页<0.05，或**第页<0.01与。*这21*⁺^/⁺SVZ；学生的t吨-测试。

图3
*这21*-逆转录病毒拯救了细胞的无抑制增殖和缺陷分化*这21*-SVZ干细胞和成神经细胞无效。（A）逆转录病毒感染和分析的方案，以及结构。**（B）**背侧SVZ区冠状断面的典型共焦图像，GFP双重标记（感染任一GFP后-*这21*或GFP-空逆转录病毒72小时）和Ki67或DCX。心室（V）由虚线勾勒。比例尺，25μm。**（C）**Ki67之间的百分比⁺/GFP公司⁺或**（D）**DCX公司⁺/GFP公司⁺细胞和感染细胞总数（GFP⁺)，从分析*这21*^-^/^-SVZ感染任一GFP-*这21*或GFP空病毒。分裂细胞的增加（Ki67⁺)分化成神经细胞（DCX）减少⁺)被*这21*病毒，相对于空病毒感染。**（E）**每SVZ区域感染细胞总数（GFP⁺)带有任一GFP-*Tis21型*或GFP空病毒。细胞数是每组三只动物分析的平均值±SEM***第页<0.001与。*这21*^-^/^-SVZ感染GFP-空病毒；学生的t吨-测试。

图4
**成年SVZ中退出细胞周期的慢分化干细胞和成神经细胞的增加*这21*击倒老鼠。（A）**P74中SVZ冠状断面的典型共焦图像*这21*⁺^/⁺和*这21*^-^/^-小鼠的背部、侧面和腹部区域（白色方框）放大率较高。图中显示B干细胞缓慢分裂（BrdU⁺/GFAP公司⁺)和保留BrdU的A神经母细胞（BrdU⁺/直流电源⁺). 比例尺，200和50μm（放大）。**（B）**BrdU处理方案，添加到饮用水中2周，然后2周不添加BrdU，并在第74页进行分析。**（C）**P74小鼠每SVZ区总数量的定量（BrdU⁺)和B干慢分化细胞（BrdU⁺/GFAP公司⁺)以及保留BrdU的A神经母细胞（BrdU⁺/DCX公司⁺)退出细胞周期；它们的数量都在增加*这21*^-^/^-相对于野生型的小鼠。细胞数量是每组三只动物分析的平均值±SEM**第页<0.01，或***第页<0.001，与。*这21*⁺^/⁺SVZ；学生的t吨-测试。

图5
*Tis21型*缺失导致SVZ细胞通过RMS向嗅球迁移的数量减少。（A）P71中中间RMS冠状切片的代表性共焦图像*这21*⁺^/⁺和*这21*^-^/^-小鼠，标记为三只（左侧；BrdU⁺/NCAM公司⁺/DCX公司⁺)或两个标记（中间；BrdU⁺/DCX公司⁺; 左侧；溴化铀⁺/NCAM公司⁺). 比例尺，50μm。**（B）**BrdU治疗方案，P60后每天注射五次BrdU，11天后进行分析（P71）。**（C）**P71小鼠整个RMS的总RMS面积（BrdU）数量的量化⁺)细胞和切向迁移的A神经母细胞（BrdU⁺/NCAM公司⁺或BrdU⁺/DCX公司⁺); 迁移神经母细胞数量减少*这21*^-^/^-小鼠相对于野生型。细胞数量是每组三只动物分析的平均值±SEM*第页<0.05与。*这21*⁺^/⁺有效值；学生的t吨-测试。

图6
*这21*缺失导致嗅球中SVZ神经母细胞衍生颗粒细胞数量减少。（A）P88中嗅球的典型共焦图像（冠状切片）*这21*⁺^/⁺和*这21*^-^/^-显示最终分化的28天龄神经元的小鼠，被鉴定为总BrdU⁺细胞或钙调素⁺神经元（分别为红色和绿色）。右侧是白色方框中区域的高倍图像。比例尺，300和100μm（放大）。在肾小球层，BrdU明显减少⁺/钙粘蛋白⁺中间神经元，来源于局部迁移并最终分化的SVZ成神经细胞。**（B）**BrdU治疗方案，P60后每天注射五次BrdU，28天后进行分析（P88）。**（C）**嗅球（OB）三层（肾小球层（GL）、中间外丛状层（EPL）和内部颗粒细胞层（GCL））中28天分化神经元（BrdU）总面积的数量量化⁺)颗粒细胞中间神经元（BrdU⁺/钙调素⁺); 后者在肾小球层中显著减少*这21*^-^/^-小鼠，颗粒细胞中间神经元分化和驻留的主要区域。细胞数量是每组三只动物分析的平均值±SEM*第页< 0.05, **第页<0.01，或***第页<0.001，与。*这21*⁺^/⁺嗅球；学生的t吨-测试。

图7
*这21*缺失并不影响SVZ外植体神经元的内在迁移。（A）P60分离的SVZ外植体的成神经细胞迁移*这21*-敲除和野生型小鼠培养8天（8DIV）。在典型的相控图像中，外植体周围明亮的区域是由移出的细胞形成的。**（B）**SVZ外植体成神经细胞迁移的定量研究(n个=每个基因型3只小鼠）。通过测量外植体周围明亮区域的面积（在**（A）**将其归一化至外植体的周长。比例尺100μm。

图8
**的静音*识别码3*BMP4的表达或治疗*这21*-无效的SVZ神经圈培养弥补了他们分化的缺陷。（A）**感染pSUPER-retro载体产生的逆转录病毒的增殖C2C12成肌细胞Id3蛋白表达分析*识别码3*-特定shRNA序列*识别码3*-190和sh识别码3-203或与表达靶向萤光素酶的shRNA的对照逆转录病毒（shLUC公司). 感染后，用G418筛选细胞10天，然后在增殖条件下培养。**（B）**来自2个月大的野生型或*这21*敲除小鼠，在分化开始前36小时转染pSR-neo-GFP-sh识别码3或pSR-neo-GFP-shLUC公司构造。分化开始72小时后对所示细胞进行分析；DCX公司⁺细胞呈红色，而成功转染的细胞呈绿色（GFP⁺). 白色箭头表示双标单元格（DCX⁺GFP公司⁺). 比例尺50μm。**（C）**早期或晚期分化神经球衍生细胞百分比的量化*这21*-null和野生型SVZ被静默*识别码3*或对照，用pSR-neo-GFP-sh转染后*识别码3*或pSR-neo-GFP-shLUC公司构造。早期或晚期分化的神经球细胞的百分比被测量为TuJ⁺GFP公司⁺或DCX⁺GFP公司⁺细胞和总GFP⁺用pSR-neo-GFP-sh转染的细胞*识别码3*或使用pSR-neo-GFP-shLUC公司。如图所示，在转移到分化培养基后48或72小时进行分析。平均百分比值±SEM来自三个独立的实验*第页< 0.05, **第页<0.01，或***第页< 0.001; 学生的t吨-测试。**（D）**来自2个月大的野生型或*这21*敲除小鼠，用BMP4（50 ng/ml）或对照溶液（载体）处理。在分析细胞后72小时，将细胞转移到含有BMP4的分化培养基中；直流电源⁺细胞显示为绿色。比例尺50μm。**（E）**早期或晚期分化神经球衍生细胞百分比的量化*这21*-用BMP4（50 ng/ml）或对照溶液处理的空白和野生型SVZ。早期或晚期分化细胞的百分比被测量为TuJ⁺或DCX⁺细胞和总细胞（识别为Hoechst⁺). 如图所示，在转移到含有BMP4的分化培养基后48或72小时进行分析。平均百分比值±SEM来自三个独立的实验*第页<0.05，或***第页< 0.001; 学生的t吨-测试。

图9
**嗅觉检测受损*Tis21型*击倒老鼠。（A）**嗅觉检测阈值是通过将动物分别暴露在一系列逐渐增加的不同气味物质浓度下，并测量它们用于研究气味与无味矿物油的时间来确定的。野生型小鼠能够检测到浓度等于或大于10的气味^-⁴%，而*这21*敲除小鼠只能检测到浓度为10的气味^-^三%. **第页<0.01和*第页与野生型相比<0.05。**（B）**动物区分不同或相似气味的能力通过习惯化-去平衡试验进行分析，在习惯化阶段，动物反复暴露于一种气味[辛醛或（-）香芹酮]，最后在去平衡试验中暴露于另一种气味[苯乙酮或（+）香芹菜酮]。在有新气味存在的情况下，嗅觉时间显著增加，表明野生型和*这21*击倒老鼠。Hab，习惯化；恶心，恶心*第页与Hab-4相比<0.05。**（C）**通过训练动物4天，使其将一种气味[辛醛或（-）香芹酮]与食物奖励联系起来，来评估长期的、有气味的联想记忆，然后在第五天，将他们在强化气味上挖掘的时间与未强化气味[苯乙酮或（+）香芹菜酮]进行比较。在本测试中，野生型和*这21*基因敲除小鼠表现出对强化关联的强烈学习**第页<0.01与未加固。数据为平均值±SEM。

**图10**
**成人SVZ神经发生控制的工作模型*这21*.**该模型在SVZ中描述了效应器*这21*抑制干细胞增殖，是神经母细胞分化所必需的体内和*在体外*.沉默*识别码3*或BMP4治疗*这21*-空神经球弥补了它们分化的缺陷，表明通过调节这些分子的表达*Tis21型*充当它们在SVZ中施加的相反作用的上游控制器，即对*同上3*和前微分*骨形态发生蛋白4*虚线仅表示相关证据。对*细胞周期蛋白D1*通过*这21*已在多个神经和非神经系统中证明（Farioli-Vecchioli等人，2007；Tirone等人，2013），而*识别码3*发起人*这21*之前已在神经细胞中显示（Farioli-Vecchioli等人，2009年）。

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