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.2014年11月；25(11):2584-95.
doi:10.1681/ASN.2013080896。 Epub 2014年4月17日。

Sall1通过激活和阻遏两种作用维持肾单位祖细胞和新生肾单位

神田修一郎 1, 谷川俊介 1, 大森友子 1, 田口Atsuhiro Taguchi 1, 库尼科·库多 1, 铃木裕中 2, 佐藤由纪 三, 日野新纪郎 4, 麦克·桑德 5, 阿兰·佩兰托尼 6, 苏米奥·苏加诺 2, 中尾光耀 7, 西村龙一 8
附属公司

Sall1通过激活和阻遏两种作用维持肾单位祖细胞和新生肾单位

神田昭一郎等。 J Am Soc肾病. 2014年11月.

摘要

肾单位祖细胞的平衡自我更新和分化对肾脏发育至关重要，部分受转录因子Six2控制，该转录因子可对抗典型Wnt信号介导的分化。核因子Sall1在Six2阳性祖细胞和分化的新生肾单位中表达，对肾脏形成至关重要。然而，Sall1的分子功能和靶点，尤其是在肾单位祖细胞中的功能和靶向，仍然未知。在这里，我们报告了Six2阳性肾单位祖细胞中Sall1缺失导致小鼠严重的祖细胞耗竭和分化肾单位的凋亡。对具有诱导性Sall1缺失的小鼠的分析表明，Sall1激活祖细胞表达的基因，同时抑制分化肾单位表达的基因。Sall1和Six2共占据了许多与祖先相关的基因位点，Sall1在生化上与Six2结合。相反，Sall1没有与Six2抑制的Wnt4位点结合。Sall1介导的抑制也独立于其与DNA的结合。因此，Sall1通过一种独特的机制维持肾单位祖细胞及其衍生物，该机制部分重叠，但与Six2不同：Sall1激活Six2阳性肾单位祖细胞核中的祖细胞相关基因，并抑制Six2阴性分化新生肾单位中的基因表达。

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数字

图1。
图1。
销售1缺失会耗尽肾单位祖细胞及其衍生物。（A） 新生对照小鼠肾脏（P0）。ad，肾上腺；bl，膀胱；儿童，肾脏；ov，卵巢。（B） 新生儿肾脏缩小Six2GFPCre；销售1flox/flox公司小鼠（P0）。te，泰特斯。（C和D）新生儿肾脏的苏木精-伊红染色。在Six2GFPCre；销售1flox/flox公司小鼠肾脏。比例尺，100μm.（E–N）Six2（肾单位祖细胞）、Wt1（肾单元祖细胞和足细胞）、LTL（近端肾小管）、THP（Henle环）和NCC（远端肾小管。肾单位成分的发育在Six2GFPCre；销售1flox/flox公司小鼠肾脏。
图2。
图2。
肾单位祖细胞在妊娠中期胚胎中耗尽。（A和B）E14.5肾脏苏木精-伊红染色。比例尺，100μm.（C和D）Six2免疫染色。与对照组相比，Six2阳性细胞较少。（E和F）Sall1免疫染色。Sall1在突变肾单位成分中的表达少得多*基质中的Sall1仍然表达。（G–J）器官培养中肾单位祖细胞的扩增。（G和H）培养开始时的肾脏（E12.5）。（I和J）培养2天后的肾脏。在培养过程中，突变肾脏中的GFP信号变得较弱。时间间隔视频如所示补充视频1(Six2GFP芯)和补充视频2(Six2GFPCre；销售1flox/flox公司). 比例尺，100μm.（K和L）GFP阳性细胞的FACS分析。在E12.5分离肾脏并培养2天。突变体中GFP阳性祖细胞的比例显著降低。三个样本的平均值（SD）。A、 面积；FSC，正向散射；PI，碘化丙啶。（M和N）GFP阳性细胞的细胞周期分析。两者之间没有区别销售1突变体和对照。三个样品的平均值（SD）。（O–T）中Sall1和Six2的双重免疫染色销售1flox/flox公司和Six2GFPCre；销售1flox/flox公司E13.5处的肾脏。Sall1在一些肾单位祖细胞（箭头）和分化肾单位（箭头）中的表达减少（红色）。基质中Sall1的表达不受影响（*）。Six2阳性细胞较少（绿色），但Sall1大多数为阴性。ub，尿道芽。比例尺，40μ米。
图3。
图3。
销售1缺失损害肾单位祖细胞的自我更新并诱导分化肾单位的凋亡。肾单位祖细胞的谱系追踪分析。比例尺，100μm.（A和B）串联二聚体番茄（tdTomato）被抗红色荧光蛋白抗体（蓝色）染色。肾单位的发育，尤其是近端小管（*）和Henle环（**），在销售1P0.突变。E14.5的（C和D）免疫染色显示td番茄阳性（红色）肾单位祖细胞（箭头）和NCAM/td番茄阳性（黄色）分化肾单位减少（箭头）。C′和D′的放大倍数较高。（E和F）E13.5处裂解caspase 3（棕色）的免疫染色。在分化的肾单位中检测到凋亡细胞Sall1型突变体。（G和H）磷酸组蛋白-H3（PHH3[棕色]）的免疫染色。在销售1突变体。ub，输尿管芽。
图4。
图4。
可诱导的销售1删除现象复制条件销售1突变体。在E12.5处注射三苯氧胺，随后进行分析。P0处Six2（肾单位祖细胞）、WT1（肾单位前体细胞和足细胞）、LTL（近端肾小管）和THP（Henle环）免疫染色。肾单位成分的发育在销售1CreER/flox公司小鼠肾脏。比例尺，100μm.（I–K）末端脱氧核苷酸转移酶介导的地高辛脱氧尿苷镍标记（红色）和NCAM（绿色）染色于E14.5。（J和K）突变株分化肾单位中检测到凋亡细胞。（K） 细胞凋亡在位于肾脏内部较深处的分化肾单位中更为显著。箭头，分化肾单位；箭头，肾单位祖细胞。比例尺，40μm.（L–Q）E13.5处Sall1和Six2的双重免疫染色。Sall1在一些肾单位祖细胞（箭头）和分化肾单位（箭头）中的表达减少（红色）。突变株中大多数Six2阳性细胞（绿色）对Sall1呈阴性*基质。比例尺，40μm。E14.5处Sall1和Six2的（R–U）免疫染色。比例尺，100μm.（V和W）E15.5处Six2的免疫染色。值得注意的是，考虑到肾脏中祖细胞（箭头）的减少，分化的肾单位（肾小泡；箭头）异常大Sall1型突变体。Six2的表达稍有夸张，因此，可以检测到表达Six2较弱的新生肾单位。比例尺，40μm.V′和W′的放大倍数较高。（X和Y）E15.5处Lef1（Wnt活性）的免疫染色。Lef1在分化的肾单位（箭头）中表达，在两个肾单位中都不包括祖细胞（箭头；虚线区域）销售1+/弗洛克斯和销售1CreER/flox公司肾脏。比例尺，40μm.ub，输尿管芽。
图5。
图5。
Sall1是肾单位祖细胞的激活剂，也是分化肾单位的阻遏物。（A） 左侧的维恩图显示了减少（上部面板）或增加（下部面板）探针的重叠Six2GFPCre；销售1flox/flox公司肾脏和销售1CreER/flox公司三苯氧胺治疗24小时和48小时后的肾脏。右边的圆形图显示了Six2-GFP阳性或阴性细胞中减少或增加基因的分布。由于探针重叠，基因数小于探针数。KO，击倒。（B和C）Cited1的免疫染色。在E12.5注射三苯氧胺，并在E14.5进行分析。Cited1的表达在销售1CreER/flox公司肾。比例尺，100μm（D和E）现场杂交第1类. The expression of奥斯1在销售1CreER/flox公司E14.5处的肾脏。（F–I）Nkx6.1免疫染色。Nkx6.1在分化肾单位（箭头）中的表达在销售1CreER/flox公司用三苯氧胺和Six2Cre；销售1flox/flox公司E14.5处的肾脏。
图6。
图6。
Sall1和Six2共占了与子代相关的位点，但没有分化相关的位点。（A） 祖先相关基因座（mm9坐标）内Sall1和Six2的ChIP-Seq分析。星号显示Sall1和Six2共占的峰值，钻石显示Park研究报告的峰值等。红色星号对应于图7中EMSA使用的区域。在第1类在严格的峰值呼叫中未检测到该位点，但EMSA验证了Sall1结合。（B） 维恩图显示了Sall1或Six2在整个基因组中结合的峰数。Six2结合峰500 bp范围内的Sall1结合峰被归类为共占。（C） 丰富的从头开始从ChIP-Seq峰区恢复的Sall1结合基序。（D和E）无Sall1结合峰重量4或新x6.1基因座。Diamond显示了Park研究中报告的峰值等.
图7。
图7。
Sall1与祖细胞相关基因座结合，在生化上与Six2和Mi2/NuRD相关。（A） Sall1的EMSA显示Sall1与祖细胞相关基因座结合。竞争对手MT，突变竞争对手寡核苷酸；竞争对手WT，野生型竞争对手寡核苷酸；IgG，抗Sall1抗体的超位移（*）的阴性对照（Sall1 ab）；Sall1、，在体外-翻译的Sall1蛋白；矢量，在体外-从空载体翻译的裂解产物。（B） Sall1与肾脏中Six2（上面板）或Mi2/NuRD复合物（下面板）的结合。使用抗Flag抗体对对照组和Sall1Flag E15.5肾脏进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行印迹。IP，免疫沉淀。（C） Sall1与Six2的结合不依赖于DNase和RNase处理。Flag-Sall1和myc-Six2在人类胚胎肾293细胞中过度表达，随后使用抗Flag抗体进行IP。内源性HDAC2也与过表达的Sall1结合。（D） 产生的重组Sall1和Six2蛋白的直接结合在体外用兔网织红细胞裂解物系统制备的重组蛋白进行混合、免疫沉淀，并用指示的抗体进行印迹。脱氧核糖核酸酶；核糖核酸酶；Six2，在体外-翻译的Six2蛋白。
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