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.2014年6月；9(6):2145-51.
doi:10.3892/mmr.2014.2099。 Epub 2014年4月1日。

β-catenin在肝纤维化中过度表达，Wnt/β-catentin信号通路阻断抑制肝星状细胞活化

文松歌 1, 王耀军 2, 吴建新 1, 剑高扇 1, 陈英伟 1, 梁祝 三
附属公司

β-catenin在肝纤维化中过度表达，Wnt/β-catentin信号通路阻断抑制肝星状细胞活化

文松阁等。 分子医学代表. 2014年6月.

摘要

β-catenin是Wnt/β-catening信号传导的核心成分，已被证明是细胞增殖和分化的重要调节因子。Wnt/β-catenin信号的异常激活促进组织纤维化。本研究分析了β-catenin在肝纤维化形成中的作用，并利用小干扰RNA研究了β-catanin基因沉默对肝星状细胞（HSC）功能的影响。采用免疫组织化学方法检测β-catenin在不同级别的人肝纤维化组织和正常人肝组织中的表达。为了抑制Wnt/β-catenin信号通路，开发了β-catentin的siRNA，并使用Lipofectamine 2000瞬时转染HSC-T6细胞。通过定量聚合酶链反应（qPCR）和western blot分析评估β-catenin的表达。用qPCR和免疫荧光染色检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。使用甲基噻唑四氮唑分析法分析细胞增殖和细胞周期。Annexin V染色检测细胞凋亡。与正常对照组相比，高度肝纤维化患者的β-catenin表达水平较高。此外，β-连环蛋白siRNA分子成功转染到HSC中，并以时间依赖的方式诱导β-连环蛋白表达的抑制。β-连环蛋白siRNA处理也抑制转染HSC中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。此外，与对照组相比，siRNA介导的HSC-T6细胞β-catenin敲除抑制细胞增殖，导致细胞凋亡。这项研究表明β-连环蛋白在肝纤维化的发展中具有重要的功能作用，并证明Wnt/β-连环素信号通路的下调抑制了HSC的激活。因此，本研究为肝纤维化的治疗提供了一种新的策略。

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数字

图1
图1
β-catenin在肝纤维化过程中上调。（A–E）肝纤维化标本中β-catenin分布和表达的免疫组织化学分析（原始放大倍数，×400）。棕色表示积极的表达。（A） 正常肝组织未见免疫反应；（B） F1肝纤维化组织弱染色；F2和F3肝纤维化组织（C和D）中度染色；（E） F4肝纤维化组织强染色。（F–J）苏木精和伊红用于检查病理改变和胶原沉积。图像F–J分别指示纤维化阶段F0、F1、F2、F3和F4。网状纤维（K-O）银染色用于检查病理改变和胶原沉积。图像K–O分别表示纤维化阶段F0、F1、F2、F3和F4。F0，无纤维化；F1，肝纤维化门管区扩大；F2，门脉周围或门脉间隔，但结构完整；F3，纤维化伴建筑变形，但无明显肝硬化；F4，肝硬化。
图2
图2
（A） β-catenin在不同程度肝纤维化中的表达水平。F0，无纤维化；F1，肝纤维化门管区扩大；F2，门脉周围或门脉间隔，但结构完整；F3，纤维化伴建筑变形，但无明显肝硬化；F4，肝硬化。β-catenin免疫反应发生率：高，>80%的细胞阳性；中间，25-80%的细胞阳性；低，<25%的阳性和阴性细胞，<5%的阳性细胞。与NG和CG细胞相比，（B–E）β-连环蛋白siRNA抑制HSC-T6细胞中β-连环蛋白mRNA和蛋白的表达。β-actin作为内负荷控制。（B） β-catenin-siRNA转染后HSC-T6细胞中β-catentin mRNA表达的qPCR分析。（C） qPCR结果的半定量分析。（D） 转染后β-catenin蛋白表达的Western blot分析。（E） 蛋白质印迹结果的半定量分析。（F–H）β-catenin siRNA抑制HSC-T6细胞中I型和III型胶原mRNA的表达。（F） siRNAβ-catenin转染后HSC-T6细胞I型和III型胶原mRNA表达的qPCR分析。β-actin作为内负荷控制。（G和H）qPCR结果的半定量分析。一P<0.05，b与NG和CG相比，P<0.01。n、 样品数量；小干扰RNA；NG，正常组；CG，对照组；定量聚合酶链反应。siRNA1，转染后24小时；siRNA2，转染48小时后。
图3
图3
（A和B）β-catenin siRNA抑制HSC-T6细胞中I型和III型胶原mRNA的表达。siRNAβ-catenin转染后HSC-T6细胞中I型胶原和III型胶原表达的免疫荧光染色分析。（C） β-catenin siRNA抑制HSC-T6细胞增殖。用MTT法分析转染β-连环蛋白siRNA的HSC-T6细胞的生长曲线。每个样品分析三份，包括误差条。与对照组和非转染组相比，转染后3、4和5天β-catenin siRNA组的增殖显著降低（P<0.05）。（D和E）Annexin V分析β-catenin siRNA诱导HSC-T6细胞凋亡。（D） HSC-T6细胞中β-catenin siRNA的凋亡作用示例。（E） 与对照组相比，β-catenin siRNA治疗后凋亡细胞的百分比增加。一与对照siRNA组相比，P<0.01。误差线表示标准偏差。小干扰RNA；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵。
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