Melanoma NOS1 expression promotes dysfunctional IFN signaling

doi:10.1172/JCI69611

.2014年5月；124(5):2147-59.

doi:10.1172/JCI69611。 Epub 2014年4月1日。

黑色素瘤NOS1表达促进功能失调的IFN信号传导

PMID： 24691438
预防性维修识别码：项目经理4001531
内政部： 10.1172/JCI69611

黑色素瘤NOS1表达促进功能失调的IFN信号传导

刘秋珍等人。临床研究杂志. 2014年5月.

.2014年5月；124(5):2147-59.

doi:10.1172/JCI69611。 Epub 2014年4月1日。

PMID： 24691438
预防性维修识别码：项目经理4001531
内政部： 10.1172/JCI69611

摘要

在多种形式的癌症中，I型IFN信号的组成型激活是针对癌症的免疫监测的关键结果；然而，从癌症患者分离的PBMC对IFN-α的反应表现出STAT1磷酸化降低，表明IFN信号功能障碍。在这里，我们在共培养系统中证明，黑色素瘤细胞不同程度地损害PBMC中的IFN-α反应，并且特定黑色素瘤的抑制潜力与NOS1表达相关。不同患者黑色素瘤细胞之间基因转录和阵列比较基因组杂交（aCGH）的比较表明，IFN-α信号的抑制与12q22-24段内NOS1位点的扩增相关。对黑色素瘤中NOS1水平和患者纯化PBMC的IFN反应性的评估表明，黑色素瘤NOS1表达与PBMC对IFN-α的反应性呈负相关。此外，在一项探索性研究中，黑色素瘤转移瘤中NOS1的表达与患者对过继T细胞治疗的反应呈负相关。这项研究提供了循环免疫细胞中癌细胞表型和IFN信号功能障碍之间的联系。

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数字

**图1。黑色素瘤细胞系对PBMC中IFN-α-p-STAT1的调节。**
(A类)左上角：25个黑色素瘤细胞系中p-STAT1水平的直方图。同位素、基础和干扰素-α-p-STAT1显示在顶部、中部和底部面板中，以说明干扰素–α-p-SATA1的变异性。左下：黑色素瘤细胞和PBMC的Transwell共培养。右：CD4中的IFN-α-p-STAT1（顶部）和基础p-STAT1（底部）⁺，CD8⁺和来自4个供体的PBMC的单核细胞亚群，在与12个黑色素瘤细胞系（蓝条）或单独（单核细胞；红条）共培养7天后进行一式三份的实验。(B类)顶部：CD4中的平均IFN-α-p-STAT1水平⁺，CD8⁺和来自4名捐赠者的单核细胞亚群与12个黑色素瘤细胞系共培养或单独培养，如A类.根据IFN-α-p-STAT1水平对共培养结果进行排名(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.005，以及****P（P）*<0.0005，Wilcoxon试验）：5个具有强烈抑制作用（与单独培养的PBMC相比，IFN-α-p-STAT1减少50%）的细胞系被确定为L-mels，其余的H-mels。底部：与L-mels或H-mels共培养的PBMC亚群中的IFN-α-p-STAT1(*P（P）*=0.0005，Wilcoxon检验）。(C类)顶部：L-mel细胞共培养前后的平均IFN-α-p-STAT1水平低于H-mel细胞系（Mann-WhitneyU型测试，*P（P）*=0.048和0.018）。IFN-α-p-STAT1仅在H-mels中与PBMC共培养后显著增强(*P（P）*=0.047，Wilcoxon检验）。(D类)黑色素瘤细胞中的IFN-α-p-STAT1与CD4共培养中的IFN-α-p-SATA1相关⁺，CD8⁺和单核细胞亚群（Spearman相关性）。

**图2。L-mels特异的转录特征。**
(A类)基于全局基因表达的PCA根据免疫表型将12个黑色素瘤细胞系分为三组。(B类)基于平均连锁的全局基因表达的无监督层次聚类。(C类)基于6771个基因差异的热图（学生的t吨测试截止时间*P（P）*<0.05）。

**图3。在独立细胞系上对L-mel签名进行功能验证。**
(A类)热图基于相同的基因，但除了最初的12个黑色素瘤细胞系（L mels，绿色；H mels，包括S mels，蓝色）之外，还包括41个额外的黑色素瘤（红色）细胞系。3个红色和3个蓝色箭头表示根据6771个基因签名，随机选择6个细胞系（3个分类为H-mels，3个归类为L-mels），用于验证PBMC的预测调制。(B类)预测为L-mels（蓝色箭头）和先前测试的L-mel（888）的3个品系显著抑制IFN-α-p-STAT1（Wilcoxon测试，*P（P）*=0.0039，适用于所有四个L型梅尔**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.005; ****P（P）*<0.0005），而3个新的（红色箭头）和之前测试的H-mels没有。

**图4。受L-mel特征影响的信号通路。**
(A类)根据IPA的IFN信号通路，其突出了L-mels中JAK1、JAK2、IFNA1和IFNA2的下调（绿色）。(B类)根据具有受体家族的IPA，G偶联受体途径。L-梅尔斯（红色）的Gi-coupled受体上调。

**图5。12q22-24扩增是L-mel的基因组标记，靶向*NOS1号*基因。**
(A类)上图：L mels（上图）和H mels（下图）的染色体扩增（红色）和缺失（蓝色）。L-mels和H-mels之间的差异集中在chr8和chr12（蓝色方块）上。底部面板：ANOVA确定的十个片段（红色三角形），比较L-mels和H-mels（截断*P（P）*<0.01，折叠变化小于-2或大于2）。这些段位于chr8、chr10和chr12中（分别为4、1和5个段）。(B类)顶部：复制chr12q22-24中的数字值，包括最重要的段和其他两个侧翼段，其中*NOS1号*基因定位（切断*P（P）*< 0.00001). 底部：维恩图，从chr12q22-24中的3个重叠片段中收集168个基因，其中6771个基因在L-mels和H-mels之间差异表达；两个平台共有19个，并显示了它们的符号。(C类)左侧：*编号1*L-mels（蓝色）的mRNA值高于H-mels（红色）(*P（P）*=0.001，曼希特尼U型测试）。右：通过细胞内FACS分析测试8个黑色素瘤细胞系中NOS1蛋白和RNA的相关性。(D类)左：之间的相关性*NOS1号*黑色素瘤细胞的mRNA值(x个轴）和IFN-α-p-STAT1水平(年轴）在相应的共培养CD4中⁺和CD8⁺T细胞和单核细胞。右：之间的相关性*NOS1号*黑色素瘤细胞的mRNA值(x个轴）及其IFN-α-p-STAT1水平(年轴）。本图中的所有相关分析均基于斯皮尔曼相关测试。

**图6。NOS1作为诱导免疫抑制因子的功能验证。**
(A类)左：CD4中的IFN-α-p-STAT1⁺和CD8⁺NONOate（NO供体）抑制后的细胞和单核细胞。中部和右侧：CarPITO（NO清除剂）和L-NAME（NOS家族非选择性抑制剂）诱导CD4恢复⁺3种L-融合蛋白对T细胞的抑制作用。(B类)左侧和中部：NOS1（NPLA）和NOS2（1400W）选择性抑制剂逆转了共培养PBMC亚群中IFN-α-p-STAT1的抑制。左图（NPLA）和右图（1400W）均逆转了L-mels对IFN-α-pSTAT PBMC亚群的抑制作用。(C类)左：NPLA逆转了纯化CD3中IFN-α-p-STAT1的抑制⁺T细胞亚群。右图：1400W在相同条件下没有效果。(D类)左图：PBMC亚群中与3个L-梅尔和1个H-梅尔共培养的硝化作用。中：PBMC亚群的硝化作用随NONOate浓度增加而增加，与IFN-α-p-STAT1呈负相关。右图：L-NAME减少PBMC亚群中的硝化作用。(E类)*NOS1号*基因敲除细胞系3107s显著恢复了CD4中IFN-α-p-STAT1的抑制作用⁺，CD8⁺与母细胞系3107或对照细胞系3107c（配对Student’st吨测试，*P（P）*=0.003（对于3107和3107c）。在所有实验中，使用的3种L-mel细胞系分别为888、3107和A375，而H-mel细胞株为1858。为了简单起见，L-mels的数据是累积的，尽管每个细胞系都获得了可比较的结果。所有实验都至少重复了六次**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.05，以及****P（P）*<0.005来自Wilcoxon检验或Spearman相关性。

**图7。黑色素瘤转移导致NOS1表达。**
(A类)9例黑色素瘤转移瘤（左）和同时收集的自体PBMC（中）中IFN-α相关信号基因的mRNA水平与健康供体PBMC相比呈倍变化。右：散点图显示前两个面板中显示的转录本的相关值，用于比较黑色素瘤转移(年轴）和PBMC(x个轴）；n个= 63. (B类)与8个可用PBMC中NOS1表达相关的体外IFN-α-p-STAT1（左）、IFN-α/p-STAT3/p-STAT1（中）和IFN-α-pIRF7（右）散点图(年轴）。(C类)左：黑色素瘤转移瘤中NOS1表达缺乏正常分布(*P（P）*<0.01，Kolmogorov-Smirnov正态性检验），并根据NOS1平均表达值（4.40）将113例患者分为高表达组和低表达组。右：黑色素瘤中NOS1的表达与治疗结果呈负相关（Spearman秩相关系数）。NOS1高表达组的NR病例显著增加(*P（P）*= 0.011, χ²测试）；(D类)左侧：*NOS1号*根据治疗反应（CR、PR和NR；*P（P）*值指的是单因素方差分析）。正确的：*NOS1号*与NR病例（未配对学生的t吨测试）。(E类)根据NOS1、NOS2和NOS3对113例转移瘤进行分级聚类，显示三组，一组NOS基因一致高表达，NRs丰富，另一组低表达，第三组表达不一致。所有相关分析均基于皮尔逊相关检验。

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