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.2014年4月3日；508(7494):108-12.
doi:10.1038/nature13110。 Epub 2014年3月16日。

肿瘤细胞对葡萄糖限制和双胍敏感性的代谢决定因素

科凡·比尔索伊 1, 理查德·波塞马托 1, Franziska K Lorbeer公司 2, Erol C Bayraktar公司 2, Prathapan Thiru公司 2, Burcu Yucel公司 2, 王铁卫 三, 沃尔特·W·陈 三, 克莱莉·克莱什 4, 大卫·M·萨巴蒂尼 三
附属公司

肿瘤细胞对葡萄糖限制和双胍敏感性的代谢决定因素

科凡·比尔索伊等。 自然. .

摘要

由于肿瘤中高消耗营养物质（尤其是葡萄糖）的浓度通常低于正常组织，癌细胞必须使其代谢适应肿瘤微环境。更好地理解这些适应可能会揭示癌细胞的负性，可以利用这些负性进行治疗。在这里，我们开发了一种连续流动培养装置（Nutrostat），用于在低营养培养基中长时间保持增殖细胞，并用它对在低糖条件下培养的条形码癌细胞系集合进行竞争性增殖分析。不同细胞系对低血糖的敏感性不同，RNA干扰（RNAi）筛选确定线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）是低血糖条件下最佳增殖所需的主要途径。我们发现，对低血糖最敏感的细胞系在OXPHOS上调方面存在缺陷，这通常是由复杂I基因中线粒体DNA（mtDNA）突变或葡萄糖利用受损导致的葡萄糖限制引起的。这些缺陷预测了当癌细胞在低血糖中生长或作为肿瘤异种移植物生长时，对双胍类药物的敏感性，双胍是抑制OXPHOS的抗糖尿病药物。值得注意的是，具有mtDNA突变的癌细胞的双胍敏感性被酵母NDI1的异位表达逆转，NDI1是一种泛醌氧化还原酶，允许绕过复杂的I功能。因此，我们得出结论，线粒体DNA突变和葡萄糖利用受损是潜在的生物标记物，可用于识别对OXPHOS抑制剂敏感性增加的肿瘤。

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数字

图1
图1。慢性糖限制下肿瘤细胞的Nutrostat设计和代谢特征
一，Nutrostat示意图。b条、Nutrostats中生长的Jurkat细胞在10 mM（黑色）或0.75 mM（蓝色）葡萄糖下的细胞数（顶部）和培养基葡萄糖浓度（底部）的变化。DT=加倍时间。c（c），在10 mM（黑色）或0.75 mM（蓝色）葡萄糖下，Nutrostats中的指示代谢物水平。d日，Nutrostats中细胞在10 mM（底部三排）或0.75 mM（顶部三排）葡萄糖下的细胞内代谢物丰度差异（p<0.05）。颜色栏指示刻度（对数2转换）。所示误差条为SEM（n=2（葡萄糖和乳酸）、3（NAD（H）比率）和8（ATP水平）。据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
图2
图2。Nutrostats中基于条形码的细胞竞争分析和RNAi筛选
一，细胞竞争实验设计。b条，以Jurkat细胞（红色）为基准，竞争分析中所示细胞系加倍时间的百分比变化。所示加倍时间显著增加（黑色）或减少（蓝色）（p<0.05）。c（c），基于RNAi的屏幕实验设计大纲。d日，初级筛选数据（平均对数210 mM（X轴）和0.75 mM（Y轴）葡萄糖中的倍变。e（电子），0.75 mM葡萄糖中优先需要的基因评分（顶部）。线粒体OXPHOS复合物图。线粒体或核编码成分的数量以及得分的核编码基因的数量（红色文本）。星号表示基因类别的重要性：复合物I（p<9.3×10−49)，III（p<6.6×10−20)，IV（p<8.3×10−10)和V（p<5.6×10−19)通过正交试验。（f），相对于10 mM葡萄糖（黑色），0.75 mM（蓝色）中表达shRNAs（顶部）和增殖（底部）的细胞受到基因抑制。星号表示与shRFP、0.75 mM葡萄糖相关的显著性（p<0.05）。误差线为SEM（n=3）。据报道，复制物是生物性的。星号（f）双侧学生t检验显示显著性p<0.05。
图3
图3。糖利用不足或复合物I是癌细胞低血糖敏感性的基础
一，将所示细胞系中0.75（蓝色）的耗氧速率（OCR）相对于10 mM葡萄糖（黑色）的变化分别（左侧）或聚合（右侧）折叠。b条，OCR相对于第三次基本测量值的变化百分比，以及在低糖耐量（黑色）或敏感线（灰色）中添加FCCP（测量值4-6）后的变化百分比。c（c），10mM（黑色）或0.75mM葡萄糖（蓝色）中的葡萄糖消耗率。d日，的表达（qPCR）SLC2A1型（黑色）或SLC2A3型指示细胞系（log）的（灰色）2相对于NCI-H929的比例）。电子频率，0.75 mM葡萄糖下指示细胞系的葡萄糖消耗率。克、对照（载体）或GLUT3过表达（GLUT3）细胞系在10 mM（黑色）或0.75 mM葡萄糖（蓝色）中的增殖（4天）。小时在给定底物的情况下，皂苷渗透线的OCR。我ND1和ND5的Sanger测序，以及相应的野生型（黑色）和突变型（红色）核苷酸和蛋白质序列。j个，在指定的细胞系中发现的复合物I基因中的mtDNA突变。k，0.75 mM（蓝色）中所示细胞系的OCR相对于10 mM葡萄糖（黑色）增加了一倍。误差条为SEM（n=6a、 b、h、k; n=5用于c（c）,e（电子）,（f）; n=3用于d、 克). 据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
图4
图4。葡萄糖利用不足或复合物I的癌细胞对苯乙双胍敏感
一在0.75 mM葡萄糖中，与第0天的ATP水平相比，通过在第3天以黑蓝标度显示的二甲双胍浓度下的ATP水平测量所示线路的存活率。值1表示完全活细胞（未经处理）。值0表示与第0天相比，ATP水平没有变化（细胞抑制）。负值表示ATP水平降低（-1表示无ATP）。b条，可行性如一在0.75和10 mM葡萄糖作用下对NCI-H2171和NCI-H929细胞株进行检测。c（c），细胞数量（顶部）和活力相对增加，如一对照（载体）或GLUT3过表达（GLUT3）细胞系（底部），在10 mM或0.75 mM葡萄糖中，与未经处理的细胞相比，在指定的二甲双胍浓度下，在10 m M葡萄糖中。d日，细胞数量（顶部）和活力相对增加，如一载体控制（黑色）或NDI1（灰色）表达系（底部），在0.75 mM葡萄糖中，与未经处理的细胞相比，在指定的二甲双胍浓度下，在0.75mM葡萄糖中。e（电子），对照品（载体）或NDI1表达品系（NDI1）的耗氧率（OCR）相对于所示二甲双胍浓度下的第二次基础测量的百分比变化。（f），从第0天开始，在饮用水中加入赋形剂（黑色）或苯乙双胍（蓝色）的小鼠中，来自对照组（NCI-H2171，NCI-H82）、线粒体DNA复合物I突变（U-937）或葡萄糖利用受损（NCI-H929）细胞系的已建立异种移植瘤的平均体积（相对于第0天）。克，平均肿瘤体积，如（f）感染对照、NDI1-或GLUT3-表达载体的指示细胞系。误差条为SEM（n=5a、 b、c（底部），d日（底部），e（电子）和（f）; n=6（控制）或n=8（GLUT3或ND11）克; n=3用于c（c）（顶部）和d日（顶部））。据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图1
扩展数据图1。低血糖和双胍敏感性代谢决定因素模型。
该图概述了储备氧化磷酸化（OXPHOS）能力、双胍敏感性和低血糖培养敏感性之间的相互作用。大多数被检测的癌细胞系和正常细胞表现出通过上调OXPHOS对葡萄糖限制作出反应的能力，使其对双胍和低血糖条件不太敏感。相反，线粒体DNA编码的复合物I亚单位发生突变或葡萄糖利用受损的细胞系，其OXPHOS储备能力有限，因此无法对双胍和低血糖作出适当反应，从而对这些扰动敏感。在极端情况下，人工构建为不含OXPHOS（Rho细胞）的细胞表现出极低的葡萄糖敏感性，但对进一步抑制OXPHOS具有抵抗力。因此，mtDNA突变癌细胞存在于OXPHOS功能的中间状态，使其对体内外双胍类药物的治疗敏感。同样，葡萄糖利用受损的细胞系在肿瘤微环境中的低血糖条件下表现出双胍敏感性。
扩展数据图2
扩展数据图2。标准培养条件下的增殖和培养基葡萄糖水平。
一，Jurkat细胞在标准培养条件下在10mM（黑色）葡萄糖与1mM（蓝色）葡萄糖下的增殖。b条，培养基中葡萄糖浓度随时间变化(一). 误差线为SEM，n=3。据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图3
扩展数据图3。支持RNAi屏幕的附加数据。
一，与0.75 mM葡萄糖相比，10 mM葡萄糖中需要的基因评分不同（顶部）。显示shRNAs评分和通路分类的百分比。与对照组（RFP）相比，免疫印迹（下图）显示shRNAs（PKM_1，PKM_2）对PKM的抑制。底部，0.75 mM（蓝色）的细胞相对于10 mM葡萄糖（黑色）的增殖含有靶向PKM或对照的shRNAs。星号表示相对于RFP 0.75 mM葡萄糖的概率值（p）<0.05。b条，核编码核心复合物I基因写在灰色框中，表示得分（右，红色文本）。点图报告了靶向非核心复合物I基因、核心复合物Ⅰ基因或非靶向对照的单个shRNAs在10 mM和0.75 mM葡萄糖中的差异重要性。红条是人口中位数。c（c），Top，非核心OXPHOS基因（黑色）和得分OXPHOS基因（蓝色）的mRNA水平在qPCR测量的shRNAs抑制后显示，相对于非靶向shRNA（RFP）。底部，0.75 mM葡萄糖与10 mM葡萄糖（未显示）中含有所示shRNAs的细胞七天增殖试验的细胞数量。shRFP控制标准化为1。误差线为SEM，n=3。据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图4
扩展数据图4。描述癌细胞系线粒体功能障碍和葡萄糖利用受损的其他数据。
一耐葡萄糖限制（黑色）或敏感（蓝色）细胞系的耗氧率（OCR）与细胞外酸化率（ECAR）之比（左）或OCR标准化为蛋白质含量（右）。b条左，通过qPCR，使用靶向ND1（黑色）或ND2（灰色）的引物将所示细胞系的线粒体DNA含量归一化为相对于KMS-12BM的gDNA重复元素（Alu）。右，通过丝裂原追踪绿色染料的荧光强度测量所示细胞株的线粒体质量。c（c），Jurkat细胞ECAR或OCR基线（第二次测量）的百分比变化，其中葡萄糖浓度保持在0.75 mM（蓝色）或增加到指示浓度（黑色）。d日，在GLUT3高（灰色）或低（蓝色）细胞系的指定时间点，在0.75 mM葡萄糖中摄取3H-标记的2-DG（每ng蛋白每分钟计数）。e（电子），顶部显示的基因和左侧显示的细胞系的基因表达值热图。按p值组织的基因在NCI-H929和KMS-26中的表达最低，在左侧为红色。报告的表达值为对数转换倍数与中间值的差异（右侧的刻度色条）。（f），指示细胞系中GLUT3和NDI1表达的免疫印迹（β-肌动蛋白负载控制）。g、 我与对照载体相比，过表达GLUT3或NDI1的细胞中细胞数量的增殖（4天）。小时，在添加指定的代谢毒素和底物后，可显示渗透细胞的OCR。j个，所指示的表达NDI1的细胞中OCR相对于对照载体的倍数变化。k-l公司，在10 mM（黑色）和0.75 mM葡萄糖（蓝色）下，对照（载体）或NDI1表达细胞系（NDI1）增殖4天。误差条为SEM，n=4a-c公司,小时,j个; n=3用于d日,克,我,k,我据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图5
扩展数据图5。识别葡萄糖利用受损细胞系的基因表达特征。
CCLE集合中细胞系右侧所示基因的基因表达值热图。根据右上角的刻度颜色条，基因表达值作为整个样本集中位数的差异进行报告。基因1-8包含用于识别葡萄糖利用受损样本的基因表达特征。根据这一特征对样本进行分类，预测显示葡萄糖利用受损的样本位于顶部。补充表4中报告了样品顺序和所有值。
扩展数据图6
扩展数据图6。GLUT3过表达增加了肿瘤异种移植物在低糖培养基中的生长和细胞增殖。
一将感染GLUT3过表达载体或感染对照载体的KMS-26细胞系按等比例混合，在不同葡萄糖浓度下培养。此外，将这些混合细胞系皮下注射到NOD/SCID小鼠体内。2.5周后，从肿瘤以及在指示的葡萄糖浓度下体外生长的细胞中分离出基因组DNA。使用qPCR，测定对照载体和GLUT3载体相对于培养物中10 mM葡萄糖的相对丰度（n=9）。b条，感染GLUT3过表达载体的KMS-26细胞系的未混合肿瘤异种移植物相对于对照载体的平均体积（2.5周）（n=6）。据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图7
扩展数据图7。桑格测序追踪证实线粒体DNA突变。
图3j中复合体I亚单位mtDNA突变汇总表复制在右下角。每个单元格行（左侧）的轨迹按表中指示的顺序显示。“反向str”表示所示序列与修订后的剑桥参考序列相反的情况。对于每条轨迹，基因序列位于左下角，DNA序列位于顶部，核苷酸变化以红色文本显示。
扩展数据图8
扩展数据图8。其他数据支持具有已识别生物标记物的细胞系对双胍类药物的超敏反应。
a-b公司，可行性(一，10 mM葡萄糖）或细胞数量的相对变化(b条4天，葡萄糖浓度显示在关键字中）。以黑蓝标度表示的二甲双胍浓度，与第0天的ATP水平相比，在第3天通过ATP水平测量存活率。值1表示完全活细胞（未经处理）。值0表示与第0天相比，ATP水平没有变化（细胞抑制）。负值表示ATP水平降低（-1表示无ATP）。c（c），可行性如(一)0.75 mM葡萄糖和10 mM二甲双胍浓度下的指示细胞系。d日左，0.75 mM葡萄糖、2 mM二甲双胍与未经处理的葡萄糖限制抵抗细胞系（黑色）和敏感细胞系（蓝色）中细胞数量的相对变化。右图，从注射PBS或二甲双胍（IP，300 mg/kg/天）的小鼠的指定细胞系中获得的肿瘤异种移植物的相对大小。e（电子），NCI-H929细胞在指定浓度的二甲双胍和葡萄糖下的存活率（a）。（f），用PBS或二甲双胍（1.7 mg/ml饮用水）治疗的小鼠中所示细胞系异种移植物的相对大小。克，对照品（载体）或NDI1表达系（NDI1）相对于第二次基础测量的耗氧率（OCR）百分比变化，以及在指定的二甲双胍浓度下。小时在0.75 mM或10 mM葡萄糖下，加或不加二甲双胍治疗，143B野生型或143B rho（无mtDNA）细胞系增殖。误差条为SEM（对于一,c（c）,e（电子）,克; n=3用于b条,d日、和小时（左）；n=5用于d日（右）和（f）). 据报道，复制物是生物性的。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图9
扩展数据图9。用二甲双胍长期治疗mtDNA突变细胞。
一、Sanger-sequencing traces of mtDNA编码的ND1和ND4基因，这些基因来自表达NDI1的Cal-62细胞或在5-20μM二甲双胍或不使用二甲双胍的条件下培养1.5个月的对照载体。包含突变序列的区域用红色方框表示。b条ND1或ND4突变的异质性水平通过测量Sanger测序曲线下的相对面积来评估并绘制。c（c）Cal-62细胞系在含有或不含二甲双胍培养1.5个月后，评估其在0.75 mM葡萄糖（蓝色）中相对于10 mM葡萄糖的增殖能力（黑色）。在不含二甲双胍的情况下进行4天的增殖试验。d日ND1和ND4的异质性水平b条给予或不给予二甲双胍治疗28天的小鼠中的Cal-62肿瘤异种移植物。误差线为SEM，n=3。复制品是生物（c）或技术（b，d），报告的手段。星号表示双侧学生t检验的显著性p<0.05。
扩展数据图10
扩展数据图10。Nutrostat设置示意图。
显示了Nutrostat组件的零件号、尺寸和尺寸。有关其他详细信息，请参阅方法。
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