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。2014年9月；60(3):1044-53.
doi:10.1002/hep.27137。 Epub 2014年5月9日。

乙醇脱氢酶III通过增强小鼠星状细胞活化和抑制自然杀伤细胞而加重肝纤维化

Hyon-Seung Yi先生 1, 李永善（Young-Sun Lee）, 金素彬, Wonhyo Seo先生, Jong-Min Jeong先生, 奥吉公园, 格雷格·杜斯特, 长谷武（Takeshi Haseba）, 孙长金, Keun-Gyu公园, Bin Gao公司, 元日正
附属公司

乙醇脱氢酶III通过增强小鼠星状细胞活化和抑制自然杀伤细胞而加重肝纤维化

Hyon-Seung Yi先生等人。 肝病学。 2014年9月。

摘要

近年来，视黄醇及其代谢产物在肝星状细胞（HSC）和自然杀伤（NK）细胞之间的相互作用中发挥着重要作用。然而，视黄醇代谢酶在这两种细胞类型中的表达和作用尚待阐明。因此，我们研究了视黄醇代谢酶的表达及其在肝纤维化中的作用。在几种视黄醇代谢酶中，仅在分离的HSC和NK细胞中检测到乙醇脱氢酶（ADH）3的表达，而肝细胞表达所有这些酶。体外用广泛的ADH抑制剂4-甲基吡唑（4-MP）处理或耗尽ADH3基因下调胶原和转化生长因子-β1（TGF-β1）基因表达，但不影响培养HSC中α-平滑肌肌动蛋白基因的表达。此外，在体外，视黄醇治疗抑制了NK细胞的活性，而ADH3的抑制增强了干扰素-γ（IFN-γ）的产生和NK细胞对HSC的细胞毒性。在体内，ADH3基因的基因缺失改善了胆管结扎和四氯化碳诱导的肝纤维化，其中检测到大量凋亡的HSC和NK细胞的激活增强。与对照小鼠相比，从ADH3缺乏小鼠新分离的HSC显示胶原和TGF-β1的表达降低，但在这些小鼠的NK细胞中检测到IFN-γ的表达增强。通过对野生型和ADH3缺陷小鼠进行相互骨髓移植，我们证明了HSC和NK细胞中的ADH3缺陷有助于抑制肝纤维化。

结论：ADH3通过增强HSC活化和抑制NK细胞活性，在促进肝纤维化中发挥重要作用，可作为治疗肝纤维化的潜在靶点。

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数字

图1
图1
4-MP治疗抑制HSC的激活。（A） 野生型肝细胞和4-MP处理的野生型HSC的RT-PCR分析。（B）野生型HSCs中ADH3、α-SMA和COL1A1的实时PCR分析。（C） 培养HSC中α-SMA、ADH3和TGF-β1的蛋白质印迹。（D） 流式细胞术检测培养HSC中Rae1的表达。（E） 培养HSC中视黄醇和atRA的细胞内浓度。（F） 4-MP处理的WT-HSC的维甲酸受体（RAR）和维甲酸X受体（RXR）的实时PCR分析。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）与相应对照组相比<0.01。
图2
图2
抑制ADH3基因抑制HSC的激活和增殖。WT和ADH3−/−分离培养HSC。（A，B）添加ADH3 siRNA后HSC的RT和实时PCR分析。（C）ADH3 siRNA后4天培养的HSC（D4 HSC）的Western blot分析。（D）HSC中ADH3 siRNA后上清液中IL-6和MCP-1的水平。（E） 用ADH3 siRNA培养WT小鼠的D4 HSC及其数量（原始放大倍数×100）。（F） WT和ADH3培养的HSC−/−小鼠接受实时PCR分析。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）与相应对照组相比<0.01。
图3
图3
视黄醇通过ADH3抑制干扰素-γ的产生和NK细胞对HSC的细胞毒性。从WT小鼠中分离的NK细胞用于在体外实验。（A） 使用肝脏NK细胞分析视黄醇代谢酶的表达。（B） NK细胞用视黄醇处理或与D4 HSC在4-MP存在或不存在的情况下共同培养3小时，然后进行RT和实时PCR分析。（C） 测定上清液中IFN-γ水平。（D） 用ADH3 siRNA或干扰siRNA处理的肝NK细胞与D4 HSC共同培养，并进行实时PCR分析。（E） 肝NK细胞作为效应细胞，在4-MP存在或不存在的情况下，对D4 HSC和Yac-1细胞进行细胞毒性试验。（F）与NK细胞共培养的D4 HSCs进行实时PCR分析。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）与相应对照组相比<0.01。
图4
图4
ADH3基因的消融通过上调NK细胞IFN-γ的生成和下调HSC的激活来抑制肝纤维化。WT和AD3−/−小鼠注射CCl4持续2周。（A） 在收集的血清中测定ALT、AST和IFN-γ水平。（B） 肝切片用天狼星红和α-SMA抗体染色（原始放大倍数，×100），与α-SMA抗体（红色）和TUNEL（绿色）共同染色，或与ADH3（绿色）和结蛋白（红色）共同染色（原始放大倍数，×800，×1200）。细胞核用DAPI（蓝色）（C）染色。肝脏MNC进行流式细胞术。（D） 对分离的肝脏NK细胞和整个肝组织进行实时PCR分析。（E） 通过共同培养WT和ADH3的NK细胞分析IFN-γ的产生及其表达−/−D4 WT HSC小鼠。（F） D4 WT HSC与WT和ADH3的NK细胞共培养−/−小鼠接受实时PCR分析。数据表示为平均值±SEM。与相应对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图5
图5
ADH3缺乏的骨髓移植可改善肝纤维化。（A） 将产生GFP的WT骨髓移植到WT小鼠后第8周。流式细胞术检测NK细胞嵌合性。（B） 在WT和ADH3缺乏小鼠之间进行骨髓互惠移植后，向小鼠注射CCl4持续2周。肝切片用α-SMA抗体和天狼星红染色（原始放大倍数×100）。（C，D）取肝组织进行Western blotting和实时PCR分析。（E） 用流式细胞术分析肝NK细胞产生IFN-γ的情况，并测定血清IFN-γ水平。（F） 通过实时PCR分析分离的肝NK细胞中IFN-γ的表达。数据表示为平均值±SEM。与相应对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图6
图6
ADH3在肝纤维化中的细胞类型特异性作用。在肝损伤期间，视黄醇在HSC和NK细胞中由ADH3代谢，这从两个方面影响HSC与NK细胞的相互作用。（A） 在HSC和NK细胞中存在ADH3时，ADH3通过表达COL1A1或激活潜伏TGF-β诱导HSC活化。同时，激活的HSC中Rae1的表达招募肝脏NK细胞，随后激活的TGF-β抑制NK细胞产生IFN-γ。此外，活化HSC释放的视黄醇被NK细胞的ADH3代谢，从而抑制NK细胞中IFN-γ的生成。（B） 在HSC和NK细胞中缺乏ADH3的情况下，HSC中COL1A1和TGF-β的表达显著降低，而HSC激活的NK细胞产生更多IFN-γ，导致HSC激活受到抑制。因此，ADH3在HSC激活中是一个正调节器，但在NK细胞产生IFN-γ中是一种负调节器。
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