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。2014年5月；4(5):554-63.
doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0929。 Epub 2014年3月14日。

多种癌症相关MTOR突变过度激活，可以预测雷帕霉素敏感性

Brian C抓具 1, 瓦伦蒂娜·纳尔迪, 科万斯·比尔索伊, 理查德·波塞马托, 匡申, 苏米·辛哈, 亚历山大·乔丹, 安德鲁·贝克, 大卫·M·萨巴蒂尼
附属公司

多种癌症相关MTOR突变过度激活，可以预测雷帕霉素敏感性

Brian C抓具等。 癌症发现。 2014年5月。

摘要

编码PI3K-AKT-mTOR信号轴成分的基因在癌症中经常发生突变，但编码mTOR激酶的基因mTOR的突变很少。利用公开的肿瘤基因组测序数据，我们生成了癌症中mTOR通路突变的综合目录，确定了导致通路过度激活的33个mTOR突变。突变集中在mTOR C末端一半的六个不同区域，发生在多种癌症类型中，其中一个簇在肾癌中尤为突出。激活突变不影响mTOR复合物组装，但一个子集减少了与mTOR抑制剂DEPTOR的结合。表达各种激活突变的细胞中的mTOR复合物1（mTORC1）信号对药物mTOR抑制仍然敏感，但对营养剥夺有部分抵抗力。最后，MTOR过度激活突变的癌细胞株在培养和体内异种移植中对雷帕霉素表现出更高的敏感性，这表明这种突变具有MTOR通路依赖性。

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数字

图1
图1。与癌症相关MTOR公司突变
1A–显示了MTOR的结构域。1B–图表显示了具有MTOR公司指示氨基酸位置的突变。图2中测试了红色样品的通路激活。1C–相同的密度图MTOR公司1B的突变识别出6个不同的突变簇，p值<0.05。1D–样本数量MTOR公司特定组织类型的突变随基因长度而变化；颜色的强度反映了该地区特定癌症亚型的样本数量。1E–5%或更多样本的癌症测序研究MTOR公司显示了点突变。
图2
图2。mTORC1和mTORC2激活MTOR公司和右侧电子束
2A–几个不同的mTOR突变体诱导S6K1磷酸化。将HA-GST-S6K1和mTOR WT或突变cDNA共同转染HEK-293T细胞，转染48小时后进行全细胞裂解。然后对裂解产物进行免疫印迹，以检测指示蛋白和S6K1的磷酸化状态。右侧显示了三个独立实验中pS6K1与HA-GST-S6K1的密度测定，误差条代表SEM。2B–几个不同的mTOR突变体诱导4EBP1磷酸化。将HA-GST-4EBP1和mTOR WT或突变cDNA共同转染HEK-293T细胞，转染48小时后进行全细胞裂解。然后对裂解产物进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质和4EBP1的磷酸化状态。右侧显示了来自三个独立实验的p4EBP1与HA-GST-4EBP1的密度测定，误差条代表SEM。2C–几个mTOR突变体诱导Akt1磷酸化。用HAGST-Akt1和mTOR WT或突变cDNA在表达载体中联合转染HEK-293E细胞，转染48小时后进行全细胞裂解，并隔夜进行0.5%的血清饥饿。然后对裂解产物进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质和Akt1的磷酸化状态。右侧显示了三个独立实验的pAkt1与HA-GST-Akt1的密度测定结果，误差条代表SEM。2D–C1483簇包含肾癌患者的非复发性mTORC1激活突变。将HA-GST-S6K1和mTOR WT或突变cDNA共同转染HEK-293T细胞，转染48小时后进行全细胞裂解。然后如上所述对裂解产物进行免疫印迹。右侧显示了来自三个单独实验的pS6K1与HA-GST-S6K1的密度测定，误差条代表SEM。2E–Rheb1突变体诱导S6K1磷酸化。用表达载体中的Rheb1 WT或突变cDNA转染HEK-293T细胞，转染48小时后进行全细胞裂解。然后如上所述对裂解产物进行免疫印迹。右侧显示了三个独立实验的pS6K1与总S6K1的密度测定，误差条代表SEM。在所有情况下，一个星号表示p值小于0.1，两个星号表示p值小于0.01。
图3
图3。mTOR突变体与Deptor结合较少，表达mTOR S2215Y突变的细胞对营养剥夺有抵抗力
3A–外源性表达的WT和突变的mTOR共同免疫沉淀同样能很好地促进内源性猛禽和Rictor，但减少了Deptor结合。用表达载体中的mTOR WT或突变cDNA共同转染HEK-293T细胞，转染48小时后制备裂解物，并对所示蛋白进行抗FLAG免疫沉淀或裂解物的免疫印迹。3B–mTOR WT和S2215Y对药理mTOR抑制同样敏感。父母TREX细胞或稳定表达mTOR WT或S2215Y的细胞按照方法中的描述用雷帕霉素或Torin1处理。然后如图2所示对全细胞裂解物进行免疫印迹。3C–S2215Y mTOR突变使S6K1磷酸化抵抗营养剥夺。父母TREX细胞或稳定表达mTOR WT或S2215Y的细胞被饥饿，并按照方法中的描述重新喂养氨基酸或葡萄糖。用上述免疫印迹法分析全细胞裂解物。
图4
图4。雷帕霉素抑制肿瘤细胞增殖MTOR公司突变
4A–具有WT或突变mTOR的多个癌细胞系的增殖对雷帕霉素治疗具有不同的敏感性。将癌细胞株接种到96孔板上，24小时后用雷帕霉素处理，并按照方法中所述使用细胞滴定仪测定细胞活力。误差线表示SD.4B–组织来源，MTOR公司图4A中显示了每个癌细胞系的突变状态、常见突变癌基因/抑癌基因和雷帕霉素IC50。与HeLa细胞移植相比，4C-HEC59细胞移植对雷帕霉素治疗非常敏感。9次注射，每次3×106将HeLa或HEC59细胞植入8周龄裸鼠的侧翼皮下。注射一周后，每天给小鼠注射赋形剂或雷帕霉素，并在另外三周内测量肿瘤大小。误差条表示SEM，两个星号表示p值小于0.05，三个星号表明p值小于0.01。
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