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.2014年3月13日；156(6):1286-1297.
doi:10.1016/j.cell.2014.01.029。

Dnmt1-依赖性CG甲基化对不同真核生物核小体定位的影响

杰森·T·赫夫 1, 丹尼尔·齐尔伯曼 2
附属公司

Dnmt1-依赖性CG甲基化对不同真核生物核小体定位的影响

杰森·T·赫夫等。 单元格. .

摘要

Dnmt1表观遗传学在许多真核生物中传播对称的CG甲基化。由于脱氨基甲基胞嘧啶修复不完善，它们的基因组中CG二核苷酸通常会耗尽。在这里，我们广泛调查了缺乏Dnmt1的不同物种，结果表明，令人惊讶的是，对称的CG甲基化仍然经常存在，并且由不同的DNA甲基转移酶家族Dnmt5催化。10亿年前分化出的许多含有Dnmt5的生物体表现出簇状甲基化，特别是核小体连接体。簇状甲基化以前所未有的密度发生，直接不利于核小体，有助于核小体在簇间定位。密集甲基化由基因组序列进化机制实现，该机制丰富了CG二核苷酸并驱动已知的最高CG频率。具有连接子甲基化的物种具有较小的转录活性核，接近染色质压实的物理极限。这些特征构成了以前未被认可的基因组结构，其中密集的甲基化影响核小体位置，可能在极端空间限制下促进核过程。

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数字

图1
图1。Dnmt1-依赖性CG甲基化与不同真核生物中的Dnmt5相关
（A） 对真核生物和细菌预测的C5胞嘧啶甲基转移酶结构域进行比对，并推断出最大似然树。灰色分支主要是细菌序列，但也包括一些来自真核生物的“孤儿”序列，而来自其他真核谱系的同源序列并不明显。真核生物家族是有色的。我们发现的家族基本上等同于使用较少序列识别的家族（Ponger和Li，2005），因此我们保留了以前的命名方案，其中包括Dnmt4、Dnmt5和Dnmt6家族。数字表示结合每个真核生物家族的节点的引导支持百分比。诸如Dnmt2、Dnmt3、Dnmt 4和Dnmt 6等不同的系列的支持较弱（49-79%的引导）。Dnmt1、色甲基化酶（Cmt）、Dim-2和Dnmt5序列的家族分组都得到了强烈支持（92-100%的引导序列）。（B） 这里描述的导致单个物种的不同谱系是单一分支。物种组显示为塌陷的节点，这表明先前为全基因组甲基化所描述的物种的最早分化时间（Feng等人，2010；Zemach等人，2010）。B.prasinos公司和卢西马林斯在同一分支上显示，因为尚未估计它们的发散时间。（C） 预测的甲基转移酶和Uhrf1在B组中显示为每个物种或组。如A组中所示，家族被着色。在组中，表示至少一个成员物种中发现的基因。虚线框突出显示了Dnmt1和Uhrf1的一般缺失，而实线框突出了Dnmt5。（D） 在B组中计算每个物种或组在每个序列上下文中的平均甲基化（从最深到最浅：CG、CHG、CHH）。对于多物种的组，每个条形代表成员物种的平均值，线条显示每个物种的潜在值范围*对于真菌，非CG甲基化通常不属于CHG和CHH类别（Zemach等人，2010年）。（E） 典型Dnmt5蛋白中的结构域；比例尺是100个氨基酸（aa）。参见图S1和表S1。
图2
图2。Dnmt5介导对称性CG甲基化
（A） 部分CG甲基化显示为Tukey在10号染色体上的中位数平滑。TE的位置显示为顶部的黑色垂直线。TEs的进一步分析见图S2B。数据显示了在ATCC（WT）和DNMT5（DNMT5）-删除了我们生长的菌株(dnmt5Δ). 我们还培养了一个对照“野生型”菌株（WT47，一个不相关基因的缺失SXI1公司)，与删除DNMT5（DNMT5）（Liu等人，2008），以确保dnmt5Δ不是菌株构建过程或生长条件的产物。这也允许评估我们的甲基化数据的再现性，该数据显示出很强的数量相似性（对于未平滑的全基因组数据，皮尔逊r=0.90）。为了进行比较，两个WT菌株的数据与dnmt5Δ菌株（两种比较的Pearson r均<0.01）。（B） 我们分析了全基因组CGCG位点甲基化的对称性。为了从分析中删除所有胞嘧啶都是甲基化或非甲基化的无信息区域，我们选择了包含至少一个高（>85%）和低（<15%）甲基化胞嘧啶的CGCG位点，并且所有胞嘧啶的测序覆盖率至少为10倍。对于每个物种中的这些信息性位点，第一条（蓝色）显示CG位点内胞嘧啶的皮尔逊r，第二条（橙色）显示相邻CG位点间内部胞嘧啶的珀逊r。CG位点对称甲基化的高分辨率示例如图S2A所示。
图3
图3。不同物种的基因组在基因体中具有周期性甲基化，而与表达水平无关
（A） 基因组甲基化快照如下所示A.无噬菌体（顶部）和E.赫胥黎（底部），每个基因模型如下。（B） 我们通过总RNA的RNA-seq评估转录。对于每个生物体，根据FPKM测量的表达（每百万映射读取的转录片段/千碱基），将基因分为5个大小相等的组（五分位）。显示了与不同五分位基因转录起始位点对齐的每个碱基对位置的平均甲基化（CG，蓝色；CHG，金色）。为了清晰起见，只显示了第一个（最低；最浅颜色）、第三个（中间；中间颜色）和第五个（最高；最深颜色）五分位的数据。根据生物体的不同，从最低到最高五分位数的平均FPKM差异约为100到1000倍。类似的图B.prasinos公司如图S3A所示。（C） CG和CHG甲基化的自相关函数估计值显示了跨最大支架的每个滞后（偏移）E.赫胥黎两者的表观周期均为182个碱基对（bp）。其他物种的自相关函数估计如图S3B所示。
图4
图4。周期性甲基化专门发生在核小体连接子中
（A） 基因组CG甲基化和核小体快照如下所示卢西马林斯（左）和pusilla乳杆菌（右）下面是基因模型。（B） 显示了甲基化和核小体在每个位置与转录起始位点对齐的平均值。（C） 显示了甲基化和核小体在每个位置与CG甲基化簇对齐的平均值。（D） 每个碱基的核小体中心计数的自相关函数估计值显示了最大支架/染色体的每个滞后（偏移）卢西马林斯和脓疱分枝杆菌明显的周期性用碱基对（bp）表示。蓝色表示CG甲基化分数，深灰色表示中心计数，浅灰色表示体内核小体的片段折叠覆盖率。黑色是裸MNase-digested的碎片中心卢西马林斯DNA与体内核小体中心大小相同。橙色是根据已发表的算法预测的核小体中心概率（Kaplan等人，2009年）。另请参见图S4。
图5
图5。甲基化以前所未有的密度发生，并有助于核小体定位
（A） 显示了每条链上含有甲基化胞嘧啶的碱基对的每个甲基化区域的密度分布。对于图1B中的每组，我们选择了基因组CG甲基化密度最高的物种（灰色）与周期性甲基化的基因组（蓝色）进行比较。硅藻和C.新生代分别为红色和黑色。对于E.赫胥黎，将CHG添加到CG站点显示为虚线框和胡须。方框表示中位数，第一和第三个四分位带有胡须，表示最极端值，最大值为距方框四分位范围的1.5倍。（B） 随着MNase数量的增加，消化显示核小体由纯化的重组组蛋白形成，或者天然甲基化卢西马林斯基因组DNA或非甲基化等效物，通过体外复制产生。M、 100bp和1kb的GeneRuler标记（Thermo）。（C–E）来自体外组装的核小体定位数据。在面板C中，显示了从天然甲基化DNA（实心深灰色线）或从非甲基化DNA组装的核小体中心的读取次数（虚线浅灰色线）。面板D和E显示了甲基化与非甲基化组件（黑线）中读取比率的以2为基数的对数，以对数为中心2（比率）=0。如图4C所示，体外核小体中心与甲基化簇（面板C、D）对齐，或与体内核小体核心的顶部基因组位置对齐（面板E）。蓝线显示CG甲基化分数，面板E中的灰色条显示用于比较的体内核小体中心。另请参见图S5。
图6
图6。CG富集基因组进化的新机制
（A） 绘制了CG背景下的胞嘧啶，即基因组碱基的百分比与单个基因组的G+C含量。颜色如图5A所示，但灰色包括大多数已公布甲基化特征的物种。CG内容的观察到的与预期的比率显示为曲线图右侧带有值的线。将CHG添加到CG站点E.赫胥黎（#1）是一个开放的蓝色圆圈。完整的图例位于右侧。（B） 替代率介于球菌属根据对齐染色体的非编码序列，使用一般可逆（R2）或一般无限制（U2）二核苷酸模型（Siepel和Haussler，2004）估算物种（表S2）。R2假设序列进化是时间可逆的，但其优点是需要估计的数学参数较少。我们展示了R2和U2模型的结果，以证明它们大体上是一致的（虚线显示了如果它们产生了相同的估计值，则表示期望值）。转换和转换分别为灰色和黑色。丢失和获得CG站点的替换分别用圆圈和钻石标记。（C） 对于图5A中的每个物种，CG二核苷酸的频率显示为每个密码子框架（相位）中所有二核苷酸的百分比（左图）。“1–2”表示密码子第一和第二位置的CG（最轻填充）。这些是指定精氨酸的CGN密码子，在A.无噬菌体,E.赫胥黎,卢西马林斯和pusilla乳杆菌.“2–3”表示密码子第二和第三位置的CG（中等填充）。这些密码子编码可由其他密码子编码的氨基酸。该框架中CG的富集导致密码子使用偏差，如右侧四个NCG密码子中每一个的相对同步密码子使用的以2为底的对数（RSCU（Sharp等人，1986））所示（最浅到最深填充：ACG、CCG、GCG、TCG）。高log2（RSCU）值A.无噬菌体,E.赫胥黎,B.普拉西诺斯,卢西马林斯和pusilla乳杆菌NCG密码子表明，这些密码子中的每一个用于编码其各自氨基酸的频率高于密码子使用无偏见的情况。“3–1”表示跨相邻密码子发生的CG（中间；最暗填充），这是CG富集不一定改变编码蛋白或引入密码子使用偏见的唯一框架。另请参见图S6。
图7
图7。周期性甲基化生物体的细胞核包含在极端空间约束下的基因组
碱基对中基因组大小的十进制对数与μm核体积三显示了单个物种/细胞类型。左边的黑线表示DNA浓度的近似上限（200 mg ml−1)核小体（Leforestier和Livolant，1997）。蓝色虚线显示了周期性甲基化细胞核中最高和最低的平均DNA浓度，约为100和40mg/ml−1分别是。作为参考，右侧的灰色虚线显示1和10 mg ml的平均DNA浓度−1周期性甲基化基因组以深蓝色显示（#9、16、17、20、24、27和28）。单倍体（1N；#16）和二倍体（2N；#9）E.赫胥黎显示了单元格类型。开放圈是指倍性尚未解决的物种。例如A.无噬菌体如果二倍体（如果2N；#17）比单倍体（若1N；#20）受限制更大。左下角的淡蓝色点是卢西马林斯,O.陶里（#28），我们没有对其进行DNA甲基化分析，但可以对其进行高度准确的核体积测量（Henderson等人，2007年）。下中心的黑点是C.新生代(#25). 我们没有发现硅藻核体积的公开数据。灰点是具有广泛空间约束的物种/细胞类型。上部中心的深灰色点是脊椎动物细胞核，其中大部分含有高度致密的异染色质（#1、2、6和7）。参考见表S3。另请参见图S7。
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