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.2014年3月13日；6(2):15.
doi:10.1186/alzrt245。 2014年电子收集。

血小板活化因子拮抗剂通过调节胆固醇酯水解酶增强神经元淀粉样β42的细胞内降解

夏洛特·西蒙斯 1, 维多利亚·英格姆 1, 阿伦·威廉姆斯 2, 克莱夫·贝特 1
附属公司

血小板活化因子拮抗剂通过调节胆固醇酯水解酶增强神经元淀粉样β42的细胞内降解

夏洛特·西蒙斯等。 阿尔茨海默病研究中心. .

摘要

简介：阿尔茨海默病特征的进行性痴呆与细胞外斑块和神经元内淀粉样β（Aβ）肽的积累有关。Aβ肽靶向富含胆固醇的膜微域，称为脂筏。观察到许多raft蛋白通过循环途径避开溶酶体，这表明神经元中Aβ的积累可能与Aβ靶向脂筏有关。在这里，我们测试了一个假设，即影响筏形成的药物可以增加神经元对Aβ的降解。

方法：用可溶性Aβ制剂孵育初级神经元。用酶联免疫吸附法测定神经元或特定细胞隔室中Aβ42的含量。研究了药物对Aβ42降解的影响。

结果：Aβ42靶向耐洗涤剂的低密度膜（脂筏），通过避开溶酶体的途径运输，并被神经元缓慢降解（半衰期大于5天）。Aβ42的代谢对药物调控敏感。在用胆固醇合成抑制剂角鲨抑素处理的神经元中，筏内的Aβ42较少，溶酶体中的Aβ42较多，Aβ42的半衰期缩短至24小时以下。磷脂酶A2抑制剂或血小板活化因子（PAF）拮抗剂对神经元中Aβ42代谢的影响与鳞茎抑素相同。PAF受体与构成胆固醇酯循环的酶一起集中在内质网（ER）中。将PAF添加到内质网膜中会激活胆固醇酯水解酶，并从胆固醇酯储存中释放胆固醇。胆固醇酯水解酶抑制剂（磷酸二乙基伞形草酯）也增加了神经元中Aβ42的降解。

结论：我们得出结论，Aβ42靶向正常细胞筏是影响其降解的一个因素。关键的是，对神经元的药物操作可以显著增加Aβ42的降解。这些结果与Aβ诱导的PAF产生控制胆固醇敏感通路的假设一致，该通路影响细胞定位，从而影响Aβ42在神经元中的命运。

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数字

图1
图1
角鲨抑素增加了Aβ的降解42.（A）免疫印迹显示7PA2细胞（7PA2-CM）（1）和Aβ缺失的7PA2-CM（2）条件培养基中的淀粉样β（Aβ）单体（M）、二聚体（D）和三聚体（T）。（B）Aβ单体、二聚体和三聚体从装载浓缩7PA2-CM的Superdex 75 PC柱（分离3至70 kDa的蛋白质）中洗脱。数值为平均Aβ42个副本。（C）用对照培养基（●）或200 nM鳞癌抑素（○）预处理神经元，用含有10 nM Aβ的7PA2-CM脉冲42，并孵育1至5天，如图所示。数值为平均值Aβ42神经元中的剩余物与进行了四次（n=12）的三次重复实验的±标准偏差（SD）。（D）用对照培养基（●）或200 nM鳞癌抑素（○）预处理神经元，用100 nM合成Aβ脉冲42，并如图所示孵育1至5天。数值为平均值Aβ42神经元±SD，重复三次实验四次（n=12）。（E）用对照培养基（■）或200 nM鳞癌抑素（□）预处理神经元，并用含有Aβ的7PA2-CM进行脉冲处理42如图所示持续2小时。数值为平均神经元Aβ42 三次重复实验的±SD（n=9）。（F）神经元，与含有10 nM Aβ的7PA2-CM孵育42连续2天，用对照培养基（■）或200 nM鳞癌抑素（□）处理24小时。数值为平均值Aβ42三次重复实验的剩余神经元±SD（n=9）*Aβ浓度42显著减少(对<0.05）。
图2
图2
角鲨抑素改变Aβ的细胞分布42.（A）Aβ浓度42在添加含有10 nM Aβ的7PA2细胞（7PA2-CM）的条件培养基后2小时，在耐洗涤剂膜（DRM）（筏）或耐洗涤剂薄膜（DSM）中42用对照培养基（■）或200 nM角鲨抑素（□）预处理的神经元。数值为三次重复实验的平均值±标准偏差（SD）（n=9）。（B）神经元的细胞提取物在蔗糖密度梯度上分离，并通过溶酶体标记物溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）的免疫印迹分析。（C）免疫印迹法显示用对照培养基或200 nM角鲨抑素处理的神经元提取物中LAMP-1的数量。（D）Aβ的量42在来源于用对照培养基（□）或200 nM角鲨烯汀（□）处理并与含有10 nM Aβ的7PA2-CM孵育的神经元的溶酶体中42持续2小时。数值为三次重复实验的平均值±SD（n=9）*Aβ浓度42明显更高(对<0.05）。
图3
图3
血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂增加了Aβ的降解42.（A）Aβ的量42在用对照培养基（●）预处理的神经元中，1μM AACOCF三（○）或1μM MAFP（□），用含有10 nM Aβ的7PA2细胞（7PA2-CM）的条件培养基脉冲42，并孵育1至5天。数值为进行四次（n=12）的三次重复实验的平均值±标准偏差（SD）。（B）Aβ的量42在用对照培养基（●）、1μM Hexa-PAF（○）或1μM银杏内酯B（□）预处理的神经元中，用含有10 nM Aβ的7PA2-CM脉冲42培养1至5天。数值为四次重复三次实验的平均值±SD（n=12）。（C）神经元与含有10 nM Aβ的7PA2-CM孵育422天后，添加1μM Hexa-PAF（○）或对照培养基（●），并添加Aβ42之后进行了测量。数值为平均值Aβ42 进行四次（n=12）的三次重复实验的±SD。（D）用对照培养基（●）、1μM PAF（□）和1μM AACOCF预处理神经元三（○），或1μM AACOCF的组合三和1μM PAF（■），并与含有10 nM Aβ的7PA2-CM孵育42持续1至5天。数值为平均值Aβ42 三次重复实验的±SD（n=9）。（E）Aβ的量42用对照培养基（●）或1μM Hexa-PAF（○）预处理神经元，用100 nM合成Aβ脉冲42培养1至5天。数值为四次重复三次实验的平均值±SD（n=12）。AACOCF公司三，花生四烯醇三氟甲基酮；十六烷基PAF，1-O-十六烷基-2-乙酰基-锡-甘油-3-磷酸-（N，N，N-三甲基）-己醇胺；MAFP，花生四烯酸甲酯氟膦酸酯。
图4
图4
血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂改变Aβ的分布42在神经元中。（A）Aβ的量42用对照培养基、1μM银杏内酯B或1μM Hexa-PAF预处理神经元提取物，并用含有10 nM Aβ42持续2小时。数值为进行四次（n=12）的三次重复实验的平均值±标准偏差（SD）*Aβ浓度42明显更高(对<0.05）。（B）用对照培养基（●）或1μM Hexa-PAF（□）处理神经元，并用含有10 nM Aβ的7PA2-CM进行脉冲处理42持续2小时。细胞提取物在蔗糖密度梯度上分离。数值为平均值Aβ42 三次试验的±SD（n=3）。（C）免疫印迹显示用对照培养基或1μM Hexa-PAF处理的神经元中溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）的数量。（D）用对照培养基（□）、1μM Hexa-PAF、1μM银杏内酯B或1μM PAF预处理神经元，并用含有10 nM Aβ的7PA2-CM进行脉冲处理42分离溶酶体2小时。数值为平均值Aβ42 进行四次（n=12）的三次重复实验的±SD*Aβ浓度42明显更高(对<0.05）。六PAF，1-O-十六烷基-2-乙酰基-锡-甘油-3-磷酸-（N，N，N-三甲基）-己胺。
图5
图5
血小板活化因子（PAF）增加了神经元内质网（ER）中的胆固醇。（A）通过密度梯度离心分离神经提取物，并分析PAF受体（□）和ER标记物Grp 78（■）。（B）用对照培养基（□）、1μM角鲨抑素或2μM PAF培养的ER组分中的胆固醇含量，或用角鲨抑制素预处理并用PAF（■）培养1小时。数值为三次重复实验的平均值±标准偏差（SD）（n=9）*胆固醇浓度明显升高(对<0.05）。（C）用对照培养基（□）、1μM鳞屑抑素或2μM PAF培养的ER组分中胆固醇酯的数量，或用鳞屑抑制素预处理并用PAF培养（■）。数值为三次重复实验的平均值±SD（n=9）*胆固醇酯的浓度显著降低(对<0.05）。
图6
图6
血小板活化因子（PAF）导致内质网（ER）中胆固醇的释放。（A）通过密度梯度离心分离神经提取物，并分析胆固醇酯水解酶（CEH）（□）和抗酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）（■）。（B）用对照培养基（□）、20μM磷酸二乙基伞形草酯（DEUP）或2μM PAF预处理或用DEUP预处理并用PAF培养的ER组分中的胆固醇含量。数值为三次重复实验的平均值±标准偏差（SD）（n=9）*显著减少(对<0.05）胆固醇高于与PAF孵育的ER组分。（C）用对照培养基（□）、20μM DEUP或2μM PAF培养的ER组分中胆固醇酯的数量，或用DEUP预处理并用PAF培养（■）。数值为三次重复实验的平均值±SD（n=9）*明显更多(对<0.05）胆固醇酯比与PAF孵育的ER组分。（D）用对照培养基（●）或20μM DEUP（○）处理的神经元用含有10 nM Aβ的7PA2细胞（7PA2-CM）的条件培养基进行脉冲处理42如图所示，孵育1至5天。数值为平均值Aβ42 进行四次（n=12）的三次重复实验的±SD。（E）Aβ的量42用对照培养基（●）或20μM DEUP（○）预处理神经元，用100 nM合成Aβ脉冲42培养1至5天。数值为平均值Aβ42 进行四次（n=12）的三次重复实验的±SD。
图7
图7
血小板活化因子（PAF）介导的胆固醇酯水解可稳定含淀粉样β（Aβ）的脂筏。示意图显示了调节含有Aβ的筏形成的假定机制。在这个理论中，Aβ42激活cPLA2从而产生PAF。PAF激活胆固醇酯水解酶（CEH）和胆固醇酯储存中胆固醇的释放，从而稳定Aβ42在木筏上。抑制cPLA2（花生四烯醇三氟甲基酮，或AACOCF三)，对PAF受体的拮抗作用（Hexa-PAF），或对CEH的抑制作用（二乙基伞形基磷酸酯，即DEUP）可降低内质网（ER）中的胆固醇浓度。中国解放军2，cPLA2是细胞质磷脂酶A2; 六PAF，1-O-十六烷基-2-乙酰基-锡-甘油-3-磷酸-（N，N，N-三甲基）-己胺。
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