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.2014年3月13日；507(7491):195-200.
doi:10.1038/nature3124。 Epub 2014年3月5日。

C9orf72核苷酸重复结构启动疾病的分子级联

亚伦·R·豪斯勒 1, 克里斯托弗·唐纳利 2, 戈兰·佩里兹 1, 埃里克·A·J·辛科 1, 帕特里克·G·肖 三, 金敏锡（Min-Sik Kim） 三, 尼古拉斯·马拉加基斯 4, 胡安·特隆科索 5, 阿克希利什·潘迪 三, 丽塔·萨特勒 2, 杰弗里·罗斯斯坦 6, Jiou Wang（王炯） 1
附属公司

C9orf72核苷酸重复结构启动疾病的分子级联

亚伦·R·豪斯勒等。 性质. .

摘要

C9orf72中的六核苷酸重复扩增（HRE）（GGGCC）n是神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传原因。在这里，我们确定了HRE结构多态性导致ALS/FTD病理和缺陷的分子机制。HRE形成具有不同结构的DNA和RNA G-四链体，并促进RNA•DNA杂交（R-loops）。结构多态性导致HRE区域中转录物的重复长度依赖性积累中止。这些转录重复序列以构象依赖的方式与核糖核蛋白结合。具体来说，核仁蛋白是一种重要的核仁蛋白，优先结合HRE G-四链体，患者细胞显示核仁应激的证据。我们的结果表明，DNA和RNA水平上不同的C9orf72 HRE结构多态性启动了导致ALS/FTD病理的分子级联，并为重复相关神经退行性疾病的机制模型提供了基础。

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数字

图1
图1。的DNA和RNAC9或72HRE型G-四联体
a）CD吸收率显示特征K+-反平行DNA G-四链体与（GGGCC）的相关光谱4.b）K的存在+退火过程中诱导构象变化，降低（GGGCC）的迁移率4凝胶迁移率变化分析中的DNA。c）DMS足迹分析（GGGCC）4当G-四联体形成时，DNA显示所有鸟嘌呤上的N7位点受到保护。d）（GGGCC）形成的反平行DNA G-四链体的拟议拓扑4。每个灰色平面代表一个G四重奏，如下角所示。四个单独的G-四分体堆叠在5´至3´之间，每个环区形成两个胞嘧啶。e）CD光谱确定了RNA平行G-四链体的形成（GGGCC）4在100 mM KCl存在下。f）（GGGCC）4与（CCCCGG）相比，在KCl存在的情况下，RNA的移动性较慢4RNA。g）核糖核酸酶T1保护试验确定不参与G-四链体形成的单链鸟嘌呤残基（用黑色表示）。h）提出的并行G-四链体拓扑由C9或72人力资源。三个堆栈形成平行的G-四链体，RNase T1敏感鸟嘌呤显示为黑点。
图2
图2。在C9或72人力资源
a）GGGGCC重复序列长度的增加以长度依赖的方式导致流产转录物的积累在体外转录产物在带有500 nt ssRNA对照（CTL）的变性凝胶上分离。b）对（a）中显示的转录物水平进行密度定量，然后绘制为包含重复区域3′的全长转录物除以包含5′区域的所有转录物的比率。曲线拟合为一个指数。数据为平均值±标准差。n个= 4.c）这个C9或72HRE诱导R-环的形成C9或72含HRE质粒（GGGCC）~70.治疗在体外RNase A和H的转录产物消化仍与松弛或超螺旋质粒杂交的RNA，并减少由RNA•DNA杂交体的大小异质性引起的涂抹。基因组DNA（顶带）起着内部负载控制的作用。d）携带C9或72HRE降低了前mRNA 3´/5´比值C9或72WT，与HRE诱导的流产转录降低全长转录水平一致。数据为平均值±标准误差。n个=5/6（B淋巴细胞），n个=12/10（运动皮层），n个=8/5（脊髓）C9或72WT/HRE样本***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05.
图3
图3。构象依赖性的识别C9或72HRE RNA结合蛋白
a）随着KCl浓度的增加，HEK293T细胞生物素化RNA下拉物洗脱的序列部分的蛋白质印迹分析。使用LC-MS鉴定的RNA-结合蛋白在识别不同结构基序的蛋白质中进行了区分，包括RNA反义（AS）发夹（CCCCGG）4;RNA感觉（S）发夹（GGGCC）4;和感觉G-四联体（G）。NCL和hnRNP U对感觉RNA的G基序具有结合偏好。hnRNP F和RPL7结合两个富含鸟嘌呤的感觉序列，而与RNA的基本结构无关。hnRNP K倾向于与富含胞嘧啶的AS结合。b）SILAC分析显示了NCL与（GGGCC）形成的G基序的优先结合的代表谱4与由正反义序列形成的发夹基序相比。c）GST-NCL的RNA下拉显示NCL直接结合（GGGCC）4核糖核酸在体外对G-四链体具有最高的亲和力。数据为平均值±标准差。n个= 3.
图4
图4。核仁应激是由来自C9或72人力资源
a）在控件中C9或72WT B淋巴细胞，NCL（绿色）定位于浓缩核仁。相反，患有C9或72HRE显示NCL扩散增加，核内核仁断裂（Hoechst，蓝色）。NCL强度的热图标志着细胞之间的差异。b）iPS运动神经元来源于携带C9或72HRE还证明NCL定位错误。β-III微管蛋白（Tuj1）（红色）用于识别神经元。c）NCL与携带C9或72人力资源。A（CCCCGG）2.5探针用于检测（GGGGCC）n RNA病灶，这是先前确定的C9或72HRE组织。d） （GGGCC）转染21流产的转录本（图2a）概括了在具有C9或72人力资源。
图5
图5。分子级联模型C9或72HRE结构多态性
GGGGCC重复区形成的DNA和RNA•DNA结构阻碍RNA聚合酶转录，从而导致转录暂停和流产。这导致全长产物的丢失和流产转录物的积累。含有六核苷酸重复序列的流产转录物形成G-四链体和发夹，并以构象依赖的方式结合基本蛋白质。这些蛋白质的序列分离导致核仁应激和其他下游缺陷。含有重复的转录物也可以逃逸细胞核并被核糖体复合体结合，从而增加重复相关的非ATG依赖性翻译，从而产生聚集性多二肽。
扩展数据图1
扩展数据图1。DNA/RNA结构多态性的光谱表征
a）来自C9或72HRE采用在KCl存在下CD光谱所示的平行G-四链构象（左）。提出的两个十核苷酸序列的分子间平行G-四链拓扑（右），形成三个5′至3′的G-四元数堆栈，其中三个或四个核苷酸（GCCG）形成一个环区。b）的互补序列链C9或72HRE（CCCCGG）4，无明显结构差异±KCl。c）CD光谱的可变性随着重复次数的增加而增加（虚线），但CD光谱可以通过拟合发夹、反平行G-四链体和平行G-四链体的三组分光谱的线性组合来概括（线），这些三组分光谱对应于0mM KCl（GGGGCC）4，100 mM KCl（GGGCC）4和100 mM KCl GGGCCGGG。拟合的残差绘制如下。d）DNA反平行G-四链体热稳定性的CD光谱分析。按照方法中所述，在10 mM Tris-HCl（pH 7.4）和50 mM KCl中，在25–95°C的温度范围内获得CD光谱。通过CD熔融光谱的奇异值分解（SVD）（Matlab）对这种两态转变进行了评估。以左系数表示的两个基组分光谱代表一个反平行G-四链体和一个未折叠的单链DNA寡核苷酸。残差显示了原始CD光谱和基组分光谱拟合之间的差异。e）增加KCl浓度会增加反平行DNA G-四链体的丰度和稳定性，如UV-VIS熔融曲线所示。CD吸光度归一化为等式(防抱死制动系统t吨–最小）*（最大–最小）−1，其中防抱死制动系统t吨是给定温度下的吸光度，max是该[KCl]在295 nm处观察到的最大吸光度，min是所有[KCl]s的最小值。数据拟合到Boltzmann分布（Prism），下边界约束设置为min。f）十聚体HRE序列形成一个平行的G-四链体，其稳定性不如反平行构象。除在260 nm处测量CD吸收率外，所得数据按上述方法进行了归一化。g）CD熔化光谱显示了从折叠的平行RNA G-四链体状态到未折叠的线性状态的两态转变。在260nm处测量的CD吸收率数据按照上述方法进行了归一化，并在无约束的情况下拟合到玻尔兹曼分布。h）（GGGCC）4形成一个不受生物素标签干扰的G-四链体。如图1所示，获得了±KCl的CD光谱，以确定K的稳定性+通过生物素标签进行化学修饰形成G-四链体。所有计算的熔化温度见扩展数据表1，结果详见补充结果。
扩展数据图2
扩展数据图2。含有HRE的质粒模板的脱毒对流产转录的贡献最小
a） S公司用于分析模板质粒上排尿水平的化学消化图。b）（CCCCGG）显示了相同的模式~70重复模板和经过哌啶处理和预先酸处理的GFP对照模板，证实重复模板中的重复道以与GFP模板类似的非特异性/自发水平基本脱尿。pCR8-70样本中的~135核苷酸5′-末端放射性标记的裂解片段作为重复区域下边界的尺寸标记，该区域对应于重复序列开始出现在凝胶上的区域。有关这些发现和实验设计的更多详细信息，请参阅补充结果和方法。c）图中显示了（b）中每条车道凝胶带的密度曲线图，以说明排尿结果。左侧面板显示了未经预处理的哌啶处理模板与经过变性/退火处理的模板（±KCl）之间的微小排尿差异。中间和右侧面板显示，与酸诱导排尿对照组相比，哌啶处理分别导致pCR8-70和对照GFP模板的最小裂解模式相似，与非特定/自发裂解产物的基本水平一致。使用ImageJ进行密度测定分析，并在Prism中绘制。
扩展数据图3
扩展数据图3。G-四联体增加了C9或72HRE区域在体外
a）一种新开发的BG4纳米体直接结合K+-依赖性DNA形成的GGGCC4.BG4纯化自大肠杆菌以及使用生物素化DNA（GGGCC）的ELISA实验4如前所述，在退火过程中加入或不加入100 mM KCl，用于确定BG4的特异性。数据显示平均值±S.D。n个= 3.b）100 mM KCl与0 mM KCl的ΔCt图显示，当含有重复序列的质粒（GGGCC）在100 mM氯化钾存在下退火时，BG4拉下了50倍以上的质粒，直接证明了序列中存在G4四倍体。补充方法中描述了BG4的DNA下拉。n个= 1.c）转录前编码区G-四链体的形成导致流产转录物提前终止，全长产物进一步丢失。通过重复区域质心的显著变化在密度图剖面下方表示偏移(n个= 5). 全长转录产物的进一步丢失如转录图谱右侧的图表所示(n个= 3).P（P）-在假设参数分布的情况下，使用配对拟合计算每个试验的值。数据为平均值±标准误差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.d）流产转录物的积累表明，转录的重复依赖性损伤不是暂时的，而是随着时间±KCl的推移而持续的。从在体外不同时间点的转录反应，然后如（c）所示进行可视化和分析。
扩展数据图4
扩展数据图4。R-环，而不是新生RNA转录物上G-四链体的形成，增加了C9或72HRE区域在体外
a）在生理相关的KCl浓度下，含有许多GGGCC重复序列的RNA转录物形成G-四链体。利用G-四链体•血红素复合物的酶样过氧化物酶活性，进行比色测定以鉴定RNA G-四链体的形成。b）转录分析的工作流注意事项。线性质粒首先在pH 7.4的10 mM Tris-HCl中退火±100 mM KCl或100 mM NaCl。为了防止盐浓度对在体外转录检测，进行第二次调整，将盐调整到检测中的最终50 mM浓度。减少对RNA聚合酶的影响使我们能够消除盐对DNA构象和新生RNA构象的影响的歧义。DNA在0 mM KCl和100 mM NaCl中退火的比较显示，聚合酶处理率也有类似的降低，这表明在新生RNA转录物上可能形成G-四链体的贡献可以忽略不计，但不排除固有RNA发夹诱导的终止。c）转录期间RNase H处理减少了流产转录物的周期性积累，并增加了全长转录物。在转录过程中使用RNase H进行处理，该酶可特异性地切割RNA•DNA杂交体C9或72重复导致从截短的转录物到全长转录物的转变，这表明在转录过程中由于非双链DNA增加而形成了被称为R环的替代二级结构。d）在含有HRE插入物的质粒（GGGGCC）中观察到R-loop的形成，但在对照中没有观察到GFP插入物。RNase A处理去除ssRNA，但不影响R环。如图2c所示，HREs诱导R环的形成，导致质粒迁移率降低，但RNase H处理可以缓解，RNase H处理可以特异性地切割RNA•DNA杂交体。RNase A和RNase H的添加对含有GFP插入物的质粒的迁移率几乎没有影响。对转录产物进行放射标记在体外转录证实了R-环的形成，这通过与具有改变的迁移率的超螺旋和松弛质粒一致的转移来证明，这通过用两种RNase处理来缓解。转录本通过包括20μCiα-[32P] UTP（Perkin Elmer），然后执行在体外如前所述的转录。e）（GGGCC）和（GGGCC）的R环诱导的质粒迁移率显著增加~70与GFP对照插入物相比，含有质粒。通过密度计测量RNase A处理后的每条带强度以及RNase A和RNase H处理后的每个带强度来量化移位的超螺旋质粒带（ImageJ，NIH）。超螺旋R-loop涂片与圆形质粒带（图2b）的重叠密度测量信号妨碍了准确定量，因此被排除在外。数据为平均值±标准误差。n个= 3. *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
扩展数据图5
扩展数据图5。SILAC方法的工作流程，用于以结构依赖的方式结合己核苷酸重复序列的蛋白质的识别和量化
将含有重、中或轻标记同位素的HEK293T细胞与（GGGCC）4G-四联体，（GGGCC）4发夹，或（CCCCGG）4发夹。然后按照方法和图3所示对样品进行处理。合并最终洗脱的样品，并使用过滤辅助样品制备（FASP）制备用于胰蛋白酶消化的样品。交换缓冲液以去除盐和SDS。然后按照方法中所述对样品进行LC-MS/MS分析。
扩展数据图6
扩展数据图6。使用从RNA下拉物洗脱部分获得的SILAC的质谱光谱示例
代表hnRNP U、hnRNP F、RPL7和hnRNP K的独特肽序列的四组光谱显示了可以使用SILAC方法确定的定量RNA结构偏好。与图3所示的工作一致，这里由独特肽谱表示的每个蛋白质显示出对RNA结构依赖性的个体偏好，如NCL（图3）和hnRNP U，或序列依赖性，如hnRNP K、hnRNP F和RPL7，如SILAC方法提供的不同同位素标记的丰度所示。补充表S1中提供了量化差异。
扩展数据图7
扩展数据图7。观察到的核仁蛋白缺陷C9或72HRE相关的ALS患者是由HRE相关转录物引起的
a）细胞核中核仁蛋白（NCL）的定量显示，NCL在B淋巴细胞、iPS运动神经元和成纤维细胞中的核弥散显著C9或72HRE患者。通过细胞核中心获得单个焦平面（Hoechst染色；蓝色）。为了量化NCL相对于细胞核大小的面积差异，在ImageJ（NIH）中设置一个较低的阈值，范围为25–75（这提供了分散NCL和致密核仁NCL的量化），用于测量NCL相对于Hoechst染色勾勒出的细胞核面积的像素面积（如图所示）。The measurements for theC9或72然后将HRE细胞归一化为对照细胞（Prism）。数据为平均值±标准误差。n个=110和n个=112，用于检测C9或72WT和C9或72HRE B淋巴细胞。n个=29，对于2的iPS运动神经元C9或72HRE患者和iPS运动神经元对照。代表性的成纤维细胞系C9或72重量，SOD1标准D90A ALS，以及C9或72对HRE进行量化。n个= 21. *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ****P（P）< 0.0001.b）患有和不患有糖尿病的患者之间的NCL蛋白水平没有显著变化C9或72HRE，尽管它定位错误。按照方法中描述的方法，使用患者和对照组的B淋巴细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。使用定量LI-COR成像仪显示条带，并使用Odyssey软件量化NCL和微管蛋白的强度。NCL水平与微管蛋白水平标准化。数据为平均值±标准误差。n个= 6.c）RNA焦点是C9或72HRE ALS病理学。运动皮层组织来自C9或72WT（非ALS）和非-C9或72sALS显示无RNA病灶或NCL共定位，这在携带C9或72HRE（图4c）。按照方法中所述获得所有图像。d）从下拉列表中确定的蛋白质hnRNP F、K和U（图3a和扩展数据图6）在携带C9或72HRE和对照，如之前在FTD患者的iPS运动神经元中观察到的。n个= 3.e）用对照转录物转染的代表性HEK293T细胞显示典型的NCL定位（绿色），而用（GGGCC）转染的细胞中观察到的核仁分散（图4d）。f）当HEK293T细胞转染（GGGCC）转录物时，与（GGGCC）相比，NCL明显定位错误三或对照记录。除无RNA和（GGGCC）外，RNA转染重复进行三数据为平均值±标准误差。n个=27、50、37和60，对于无RNA、CTL RNA（GGGCC）三和（GGGCC）21分别是****P（P）< 0.0001.克)转染（GGGGCC）的HEK293T细胞的细胞活力显著降低21与对照RNA转录物相比，流产的RNA转录物。用HEK293T细胞在96-well平板上进行细胞毒性测量，HEK293细胞转染了0-500 ng/mL的对照RNA或（GGGGCC）21由在体外如前所述，如图2a所示。使用Cytotox-Glo试剂盒（Promega）测量细胞活力，在Synergy H1微孔板阅读器上测量荧光（活细胞）和发光（死细胞）。数据为平均值±标准差。n个= 3. *P（P）< 0.05.
扩展数据图8
扩展数据图8。携带C9或72HRE显示表明核仁应激的表型
a）另一种核仁成分，核磷蛋白/B23（绿色），显示了NCL在B淋巴细胞中的分散定位C9或72HRE患者。B23（小鼠单克隆抗体，B0556，Sigma）IF染色遵循制造商的建议和方法中描述的方案。按方法所述获得B淋巴细胞图像。b）携带C9或72HRE的量化与NCL类似（扩展数据图7a）。数据为平均值±标准误差。n个=38和n个代表=49C9或72WT和C9或72HRE B淋巴细胞*P（P）< 0.05.c）描述了发生在核仁中的45S前rRNA加工成成熟的28S、18S和5.8S rRNA。d）携带45S前rRNA到28S、18S和5.8S rRNA的患者成熟度受损C9或72人力资源。患者的B淋巴细胞(n个=6）显示45S rRNA处理减少，但携带C9或72相对于控件的HRE(n个=4、3和6C9或72WT，非-C9或72ALS和C9或72HRE）。此外，ALS患者不携带C9或72HRE显示45岁成熟期无明显损伤（非-C9或72HRE ALS公司，n个= 3). 45S、28S、18S和5.8S rRNA的引物（扩展数据表1）已在前面进行了描述。成熟rRNA水平的线性倍变化相对于亲本45S rRNA水平进行了标准化。数据为平均值±标准误差*P（P）< 0.05.
扩展数据图9
扩展数据图9。来自携带C9或72HRE显示P小体数量增加，对衣霉素的敏感性增加
a）在携带神经干细胞的患者的iPS运动神经元中，处理体（P体）的数量显著增加，但大小没有增加C9或72人力资源。每个iPS神经元的P小体总数几乎增加了两倍C9或72HRE患者。在两个独立的患者iPS运动神经元系和两个对照系中，对30个视野的P小体的数量和大小进行了量化。数据为平均值±标准误差。n个= 43. *P（P）< 0.05.b）使用DCP1A抗体（Abnova H00055802-M06，绿色）对iPS神经元中P小体的代表性图像进行可视化和量化，并在补充方法中描述成像和分析。c）随着衣霉素剂量的增加，细胞死亡百分比的变化表明，在C9或72HRE iPS运动神经元比对照神经元多。此外，与对照组相比，0.3μM的衣霉素反应存在显著差异C9或72HRE和C9或72WT iPS运动神经元。对每个iPS系进行两次分化，并对不同浓度（0.0、0.1、0.3、0.6、1.0和3.0μM）的膜霉素敏感性进行两次分析。PI阳性iPS神经元的平均数量被归一化为来自同一线路的未经处理的iPS神经元。数据为平均值±标准误差。n个=69/58（0.0）、62/69（0.1）、75/55（0.3）、54/49（0.6）、55/52（1.0）和60/53（3.0）C9或72WT/HRE样本**P（P）< 0.01.d）代表性iPS运动神经元图像显示PI染色增加（白色），以响应衣霉素浓度的增加（补充方法）。
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