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.2014年2月21日；9（2）：e87388。
doi:10.1371/journal.pone.0087388。 2014年电子收集。

人iPS-源多巴胺能神经元的生理特性

伊丽莎白·哈特菲尔德 1, 山崎美智子（Michiko Yamasaki-Mann） 1, 雨果·里贝罗·费尔南德斯 1, 简·福尔斯 2, 威廉·S·詹姆斯 2, 莎莉·A·考利 2, 理查德·韦德·马丁斯 1
附属公司

人iPS-源多巴胺能神经元的生理特性

伊丽莎白·M·哈特菲尔德等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）具有研究其他难以获得的细胞类型的潜力。关键在于hiPSC定向分化为功能性细胞系。这与神经疾病的研究特别相关，例如帕金森氏病（PD），其中中脑多巴胺能神经元在疾病进展过程中退化，但在死后才能获得。在这里，我们报道了一项关于人类多巴胺能神经元在体外随时间生理成熟的详细研究。我们首先将hiPSC细胞系生成并分化为中脑多巴胺能神经元，并通过演示多巴胺的合成、释放和再摄取来进行综合表征，以确认多巴胺能功能。神经元培养物包括酪氨酸羟化酶（TH）和G蛋白激活的内向整流钾通道2（Kir3.2，以下简称GIRK2）阳性的细胞，它们代表易患PD的黑质致密部（SNc）神经元A9群。结合钙成像和电生理学，我们首次观察到慢自主起搏（<10 Hz）的成熟和成熟SNc多巴胺能神经元典型的自发突触活动。hiPSC衍生的神经元在神经元过程中表现出依赖于肌醇三磷酸（IP3）受体的细胞内钙从内质网释放，如钙波从树突顶端和远端以及胞体中传播。最后，神经元易受多巴胺神经元特异性毒素1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）的影响，这种毒素会降低线粒体膜电位并改变线粒体形态。成熟的hiPSC衍生多巴胺能神经元提供了一个以前无法访问的脆弱SNc多巴胺能神经的神经生理学定义模型，以弥合临床PD和动物模型之间的差距。

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数字

图1
图1。来自正常皮肤人成纤维细胞的hiPSC株的特征。
A） 选择两个hiPSC株系进行深入分析，即NHDF-1和NHDF-2。这些重新编程的菌落显示出类hESC的形态，例如，紧密堆积的菌落具有较高的核质比（顶行）。这些菌落表达多能性标记hNanog、hOCT4、SSEA-4和TRA-1-60。比例尺：100µm。B） 使用Illumina Human CytoSNP-12芯片进行基因组完整性分析，使用Karyostudio和M-FISH进行分析。顶部面板显示了三个衍生hiPSC克隆（iPS-NHDF-1、-2和-6）的Illumina分析，以亲代成纤维细胞为参考（NHDF）。这两项分析表明iPS-NHDF-1和iPS-NHDFS-2的染色体补体正常，总体结构没有异常，但iPS-NHDF-6显示了部分染色体2，t（X:2）的易位和扩增，未用于进一步的实验。地理位置：GSE43904。C） iPS-NHDF-1和iPS-NHDF-2细胞系能够分化为三个胚层在体外左栏显示使用Aggrewells强制聚集hiPSC 4天后类胚体（EB）形成。第二列，定向分化为神经外胚层，显示神经元使用TujI抗体染色βIII微管蛋白。第三栏，向中胚层定向分化，显示细胞被抗α-肌动蛋白（ASA）抗体染色。第四列，直接分化为内胚层，显示细胞核被抗转录因子FoxA2抗体染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：100µm。D） Illumina HT12v4转录组阵列数据的PluriTest分析显示，iPS-NHDF-1和iPS-NHDFS-2与多能干细胞（红云）聚集，而不是与部分或分化细胞（蓝云）聚集。每个圆代表一条iPSC线：1=iPS-NHDF-1；2=iPS-NHDF-2；C=控制iPSC线iPS-DF19.9.11TH。地理位置：GSE43904。
图2
图2。人类多巴胺能神经元的分化。
A） hiPS细胞定向分化为多巴胺能神经元。根据中脑模式，人工传代神经前体细胞（第16+天）。实验前，多巴胺能神经元共成熟6-10周。B） 不同分化阶段细胞基因表达的RT-PCR分析（EB：第0天，玫瑰花：第16天，神经元：第35天）。随着细胞分化，多能性基因（OCT4和SOX2）下调，同时中脑多巴胺能基因表达上调。中脑多巴胺能神经元标记物（PITX3、NURR1、EN1、TH和GIRK2）在分化的神经元群体中强烈表达。C） TH（底部面板）的免疫细胞化学染色显示大量神经元。大型神经元簇表达底板标记FOXA2（顶面板）。比例尺：70µm。D） 中脑转录因子PITX3和NURR1在分化神经元中表达。比例尺：70µm。E） 多巴胺能分化的效率通过至少3个独立的分化进行量化。iPS-NHDF1和2株分化为神经元的效率相似（39.59%±3.56和41.73%±2.02，表达为Tuj1/DAPI）。多巴胺能神经元的比例也相似（NHDF1:50.35%±3.4，NHDF2:52.54%±2.76）。TH细胞总数+NHDF1和NHDF2分别为19.21%±2.05和21.5%±1.53。数据表示为平均值±SEM。F）分化神经元的Co-labelling显示多巴胺能神经元蛋白如DAT和VMAT2以及TH的表达。A9多巴胺能神经标记物GIRK2也在一些TH阳性细胞中表达。比例尺：70µm。G） MAPT外显子剪接分析表明，分化神经元的剪接模式与人类成年皮层相似。在未分化的hiPSC中观察到外显子2、3和10的外显子跳跃，这是胚胎神经组织的典型特征。
图3
图3。分化神经元培养中的功能性多巴胺合成和稳态。
A） 不同成熟阶段（EB：第0天，Rosette：第16天，Neuron：第35天）细胞中参与多巴胺合成和稳态的蛋白质的Western blot分析。hiPSCs不表达TH、DAT或AADC，但在培养分化的细胞中表达。DAT仅在分化神经元中表达。B） 分化神经元中多巴胺的免疫染色。该标记与TH表达共定位。比例尺：70µm。C） 用高效液相色谱法测定分化神经元的多巴胺含量。分化神经元（培养总共35天）产生多巴胺（48.98 pmol/mg±0.389），对左旋多巴有反应（933.14 pmol/mg±220.71），表明AADC活性高。所示数据来自2个独立实验中的4-6个孔，用平均值±SEM表示。D）功能性多巴胺转运体活性通过三分化神经元对HDA的摄取。通过马津多抑制DAT特异性摄取。数据表示为平均值±SEM。
图4
图4。人类中脑神经元培养成熟的功能特征。
（A） hiPSC衍生神经元在特定时间点（从左面板：培养6、7、8、9和10周）的典型电流灯记录（400 ms电流脉冲和注入40–50 pA）。神经元表现出反映成熟的静息膜电位变化（6周：～−35–40 mV，10周：～–65–70 mV）。这些记录在没有显示起搏活动的神经元中。（B） 全细胞膜片钳电流钳结构中的典型起搏放电痕迹和（C）10周龄神经元培养物中记录的自发EPSCs的典型痕迹（n>6个神经元显示自发起搏活动）。插图显示分化神经元中TH和突触囊泡蛋白SV2共同表达的固定细胞上的免疫染色。从NHDF-1和-2线获得了类似的记录。
图5
图5。钙的动态变化2+神经元成熟过程中的信号。
痕迹显示钙的自发变化记录2+诱导hiPS细胞向多巴胺能神经元分化后的信号。观察到其动力学的渐进性变化，从6周及以后的分化过程中，节律性明显增加。培养8周后，在体细胞和神经元突起中观察到多巴胺能神经元典型的振荡活动（每个时间点n>6）。从NHDF-1和-2行获得记录，并给出类似的结果。
图6
图6。人类hiPS细胞源神经元中的自发细胞内钙信号。
（A） 固定TH阳性神经元（红色）表达肌醇三磷酸受体（IP）的免疫染色三Rs）在胞体和树突过程中（绿色）。活细胞成像显示IP三-在过程（B，上蒙太奇）和体细胞（B，下面板）中均检测到BM诱发的钙信号。上方蒙太奇图中的黄色斑点表示与时间相关的荧光变化，表明钙波通过神经元过程传播。下部面板中的荧光剖面显示了从体细胞（1）获得的荧光变化。之前和2。钙浓度升高后）。（C） 左侧显示分化神经元中LysoTracker敏感酸性细胞器的典型分布。右侧图像显示，应用NAADP/AM后钙波的传播起源于神经元胞体向树突过程。记录是从2条不同的线路获得的（n>3）。
图7
图7。线粒体膜电位的测定及其对MPP的敏感性+.
（A） 用线粒体膜指示剂TMRM负载分化的人类神经元培养物。在应用膜电位解偶联剂CCCP之前（左上）和之后（左下）测量荧光变化。右侧面板显示了从左侧面板中标记的3个感兴趣区域获得的荧光变化的量化。在一些细胞中观察到膜电位的诱导和自发波动，并且可以在单个线粒体水平上检测到这种变化（ROI 3）。（B） 上图表示从细胞体测得的平均线粒体静息电位以及接触多巴胺能神经元毒素MPP的影响+持续24小时，MPP后平均静息荧光强度显著降低+治疗（对照，F.U.68.8±13.4×10三和40µM MPP+，F.U.43.6±2.9×10三t<0.05，n>40）。下部面板显示MPP+治疗后线粒体形态发生变化。
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