跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2014年3月18日；53（10）：1697-713。
doi:10.1021/bi4016082。 Epub 2014年3月7日。

单分子研究揭示了膜结合蛋白激酶C-α激活机制中隐藏的关键步骤

布莱恩·普·齐安巴 1, 李嘉宁, 凯尔·E·兰德格拉夫, 杰斐逊·D·奈特, 格雷戈里·A·沃思, 约瑟夫·福克
附属公司

单分子研究揭示了膜结合蛋白激酶C-α激活机制中隐藏的关键步骤

布莱恩·普·齐安巴等。 生物化学. .

摘要

蛋白激酶C-α（PKCα）是蛋白激酶C亚型（cPKC）的传统家族成员，调节多种细胞信号通路，共享共同的激活机制，并与多种病理学相关。cPKC结构域是模块化的，由一个N端假底物肽、两个抑制域（C1A和C1B）、一个靶向域（C2）和一个激酶域组成。成熟的细胞质cPKC在被主要发生在质膜表面的多步骤活化反应激活之前是不活跃的。通常，这种激活始于细胞质Ca（2+）信号，该信号触发C2域靶向质膜，在质膜上结合磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）。随后，信号脂质二酰甘油（DAG）的出现通过从激酶结构域招募抑制性假底物和一个或两个C1结构域来激活膜结合酶。为了进一步研究这一机制，本研究利用单分子全内反射荧光显微镜（TIRFM）来定量全长PKCα和缺失特定结构域的片段在支持的脂质双层上的结合和横向扩散。通过对平衡结合颗粒密度和二维扩散率的影响，检测到脂质结合事件以及在双层中插入额外蛋白质的事件。除了先前提出的活化步骤外，研究结果还揭示了一种未描述的主要激酶活性中间体。在含有PS或PS和PIP2的双层上，全长PKCα首先通过其C2结构域与膜对接，然后其C1A结构域甚至在DAG出现之前就嵌入双层中。在等待DAG信号时，产生的具有膜结合C1A和C2结构域的DAG前中间体是PKCα的主要状态。新检测到的这种DAG前中间体的膜嵌入C1A结构域具有多种有用的特征，包括增强的膜亲和力和更长的结合态寿命。研究结果还确定了激酶激活的关键分子步骤：因为C1A已经被膜包埋在激酶关闭状态，DAG或佛波酯向双层招募C1B是稳定激酶开启状态的关键调节事件。更广泛地说，这项研究说明了单分子方法在阐明膜结合信号蛋白的激活机制和隐藏调节状态方面的威力。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
常规蛋白激酶C结构域结构与简单活化模型。（A） 传统蛋白激酶的模块结构域组织C亚型α、β和γ（cPKCs），包括N-末端抑制性假底物肽（P），双抑制C1结构域（C1A和C1B），血浆膜靶向C2结构域，以及C末端Ser/Thr激酶结构域。（B） 简单的cPKC激活模型基于现场广泛的当前数据,,,,,,,−以及最近的开创性结构研究。,针对Ca2+信号，成熟但不活跃细胞质cPKC（i）通过其C2结构域与质膜PS对接，产生（PS）2状态（ii）。C2域迅速取代一种不太常见但亲和力较高的PS脂质2，触发膜对接几何形状的变化，因为大型PIP2头部组，产生（PS-PIP2)状态（iii）。之后，在DAG脂质信号中，蛋白质仍然被激酶结构域与抑制剂的相互作用所抑制元素，遇到并结合两个招募C1A的DAG分子和C1B进入膜，从而解除抑制和激活处于状态（iv）的激酶。所示的蛋白质结构基于关于PDB条目3PFQ（28）和1PTQ的晶体结构。复杂结构基于参考文献（28）。脂结合化学计量学来自参考文献（−39）、（100）和（101）。膜对接几何图形基于参考文献（28）、（42）和（91）。
图2
图2
精心设计的全长使用的PKCα和截断构造在本研究中。所示为人类PKCα的域布局为本研究设计的构建物，与WT PKCα进行比较（图1A中定义的原生域）。每个工程构建包含荧光标记标签（Sfp酶共价结合的11-残基ybbr靶肽将荧光偶联）和亲和标记（9残基HA肽或麦芽糖结合蛋白（MBP）]。截断边界如下：C1A–C1B–C2（残基26–294）、C1B–C1（残基90–294）、C2（残留157–294个）、C1A–C1B（残留26–165）、C1A（残基26–100）和C1B（残基90–65）。
图3
图3
α膜结合和激酶活化的依赖性，和结构域膜结合，影响脂质组成。（A和D–F）单分子TIRF定量结构与载体的结合脂质双层，归一化为相同的总蛋白浓度（1 pM）。在成像室中添加了一个给定的结构，其中包含所示支撑双层（表1），然后是单位面积的荧光蛋白结合密度已量化。每个平均值由20个暂时隔离的来自至少五个独立电影流中三个独立电影的帧实验(n个≥ 15). 游离Ca2+生理缓冲液中的浓度为6μM（材料和方法）。（B） 总激酶活性通过修饰的PepTag测量荧光标记的PKCα（Promega）分析（材料和方法）。这个酶被含有相同脂质成分的膜激活作为结合密度测量和PKC特异性磷酸化通过电泳对PepTag靶肽进行定量。每个条件重复两次(n个= 4)以及使用不同PKCα和/或脂质浓度的单独实验证实酶没有饱和。（C） 特定活动由激酶活性与结合率决定的PKCα每个双层条件下的密度。在所有实验中，T型=22±0.5摄氏度。在本图和后续图中，由纯单分子数据确定的平均参数为用<参数>表示。
图4
图4
PKCα和C2结构域膜结合的依赖性PS摩尔上密度。膜结合密度通过单分子进行量化TIRF如图3图例所示。全长PKCα或C2结构域的固定浓度（5pM）添加到含有增加摩尔数的支撑PC双层中PS组分和荧光膜结合蛋白的密度从三个单独的框架中测量了20个暂时隔离的框架三个独立滴定实验中的电影流(n个= 9). 希尔方程的最佳拟合得出了指示值属于K1/2和希尔系数。在两者中实验，游离钙2+浓度为6μM在22±0.5°C的生理缓冲液（材料和方法）中。
图5
图5
单件步长自由扩散全长PKCαC2结构域与前DAG双层结合。量化步长由TIRF对所示支撑双层上的单粒子轨道脂质成分。（A） 平均初始步长的比较PC/PS双层膜上的PKCα和C2结构域。初始步骤长度是在单粒子扩散轨迹（轨迹的第二帧是量化，因为第一帧通常捕获部分步长粒子结合后），通过平均初始值确定每次实验至少200个粒子轨迹的步长（≥30000步）在三个单独的实验中(n个≥ 600). 数据归一化为FL PKCα的初始步长（0.40±0.04μm）。（B和C）步长的时间依赖性粒子结合后最初320毫秒内的连续步骤至所示双层。扩散的第二个20ms步骤轨道作为起点（参见面板a的图例），长度为每个扩散轨迹确定指示步骤的，以及相应台阶长度的平均值至少为200三个独立实验中的粒子轨迹(n个≥600）生成指定的时间进程。最后，这两门时间课程在每个盒子中，标准化为FL-PKC的初始步长。在所有实验中，游离钙2+浓度为6μM在22±0.5°C的生理缓冲液（材料和方法）中。
图6
图6
测量和计算全长和模拟序列脂质双层上截短的PKCα结构结合和激酶激活。在质膜上，PKCα分子通常会遇到并结合PS，然后是PIP2，然后是基于这些脂质的摩尔密度降低的DAG（见正文）。所示支撑双层组分（摩尔表1中的百分比）模拟此序列通过允许蛋白质首先与PS（A）平衡结合，然后带PS和PIP2（B） ，然后使用PS、PIP2和DAG（C）。黑条是平均实验扩散所示双层上每个结构的常数（支撑物的表2和表S2信息），通过单分子TIRF分析确定在至少五个实验中至少有2500条扩散轨迹(n个≥ 5). 白条表示预测的扩散常数通过所示双层上每个多域结构的新模型（图7和10A）通过结合实验扩散常数计算的成分拟接触双层的结构域（等式1和2以及支持信息的表S2）。对于涉及以下内容的联系人C1A和/或C1B域，计算包括加权平均值这些域的多个观察状态（支持信息表S2）。灰色条扩散通过替换C1A–双层摩擦预测的常数具有假底物肽双层的新模型（白条）摩擦力，使用已知的更紧密结合的摩擦力，更深入穿透MARCKS肽作为上层N端伪基板的预期摩擦极限区域。对于每种膜类型，这种肽假说都无法解释观察到的扩散常数，证实C1域-膜为了解释观察到的总摩擦，接触是必要的。总共实验，游离钙2+浓度为6μM在22±0.5°C的生理缓冲液中。
图7
图7
的示意图模型PKCα活化反应显示区间和膜接触。所指示的状态中的四个[（II）、（III）、（III），（五） ，和（VI）]类似于以前的模型，而新的DAG前中间体[（IV）]是根据新数据提出。新中间体（IV）已经在单分子扩散研究中直接检测到（见结果），是主要的等待中间体激活DAG信号的出现。缓慢的2D扩散这种中间层的出现源于将其C1A域部署到双层，如图所示。DAG与该膜部署C1A的结合域（IV）被提议触发瞬态的形成（五） ，尚未检测到，其中DAG与C1A的绑定可能会发送信号通过C1A–C1B连接器帮助消除抑制来自激酶结构域的C1B结构域和/或帮助引导C1B到达膜。由此产生的状态激酶通过DAG的结合而稳定分子转化为C1B，从而捕获其膜包埋状态（VI）。域之间的线表示抑制接触（带有横杆）或其他蛋白质接触；问号表示可能的但尚未完全确认的联系人。灰色触点表示相互作用的潜在减弱。水平线表示双层表面。
图8
图8
DAG和PMA的效果比较关于PKCα激酶特定活动。PKCα激酶总活性及其结合双层上PKCα的密度如图3中含有3:1 PC/PS双层和活化二酰甘油的指示水平和/或佛波酯PMA（激活脂质浓度为48或360 nM分别对应于双层中的2.0或7.5 mol%）。比活性计算为激酶活性与每个双层条件下的膜结合酶密度。每个酒吧根据每个激酶和结合测定的两个重复项计算(n个= 4). 在所有实验中，游离钙2+在22±0.5°C下，激酶测定缓冲液（材料和方法）中的浓度为6μM。
图9
图9
全原子MD孤立C1A域和C1A–C1B–C2的模拟构造绑定到PC/PS双层。（A） 膜插入[测量每隔0.54 ns，作为与重心（COM）的距离蛋白质到双层PC平均N平面]随时间变化生产运行。（B） C1A域的卡通表示（青色）显示锌离子（银球），蛋白质的质量中心（COM，红色球体），双层N平面为蓝线。在左边是59毫微秒运行时浅层状态（8.7奥）的快照2和右侧C1A深能级（0.3º）的快照245 ns的运行1。详细的构象分析表明赖氨酸（K45、K62和K76）和两种精氨酸（R42和R77）是参与静电相互作用的主要残基浅层状态下的C1A域和PC/PS头组。四个观察到这些残基（R42、K62、K76和R77）形成围绕C1A域中间的带电“半圆”以稳定深插入状态。值得注意的是，在深度状态下，K45和主链之间形成稳定的氢键F43的氧原子稳定埋电荷，而阳离子-πK45和F43或F44侧链之间的相互作用也可能起作用K45在深部状态下的稳定性。此外，>60%这个深部C1A构象与PS相关，而无观察到浅态构象结合PS。（C）向下观察垂直于C1A–C1B–C2双层表面的膜10后在双层（灰色）上构建（表面表示）ns全原子MD模拟。模拟由首选每个单独域的膜对接几何形状（图9B和参考（36）），以及带域间连接件（红色杆、H和侧链隐藏的原子）延伸而没有空间冲突。结果模型是在整个模拟过程中，膜保持稳定。N′和C′表示片段的截断N端和C端用于实验研究（图2）和MD模拟。
图10
图10
扩展PKC激活两个PKCα的模型和亚群通过单分子扩散研究检测活化状态。（A）PKC活化的扩展结构模型显示了新发现的，主要的DAG前中间体（IV），其中C1A和C2结构域与双层接触。所示的四种状态[（II），（III），（五） 和（VI）]类似于以前的模型，而DAG前中间体（IV）是新颖的。这个所示结构得到可用证据的支持，但目前数据不排除替代结构（支持信息图S2）。（B） 单分子PKCα单分子扩散的TIRF分析表明（四） 膨胀活化反应中的（VI）和（VI）（见图7）分别由两个主要亚群组成如图所示。相对人口规模由多个州决定单分子扩散数据在每种支撑类型上的拟合双层（支持信息表S2）。域下标表示蛋白质进入膜（s代表浅层，d代表深层）。问题标记表明N端伪基底区域的状态在非活性DAG前中间体（IV）中未解决：因为肽-双层接触的摩擦预计会可以忽略不计，扩散分析无法确定肽仍然与激酶活性位点结合或与双层结合建议用于激活状态。,
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Nishizuka Y.（1995）蛋白激酶C和持续细胞反应的脂质信号。法塞布·J·984–496。-公共医学
    1. 邓普西E.C。；牛顿A.C。；莫奇利·罗森D。；字段A.P。；雷兰德·M·E。；Insel P.A.公司。；Messing R.O.（2000）蛋白激酶C同工酶和不同细胞反应的调节。美国生理学杂志。279，L429–L438。-公共医学
    1. 格里纳·E·M。；Kazanietz M.G.（2007）蛋白质激酶C和其他二酰甘油在癌症中的效应。《国家癌症评论》7，281-294。-公共医学
    1. 埃文斯·J·H。；Falke J.J.（2007）Ca2+内流是维持巨噬细胞前沿结构和活性的正反馈回路的重要组成部分。程序。国家。阿卡德。科学。美国104、16176–16181。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 加列戈斯。；Newton A.C.（2008）脂质信号传导的时空动力学：蛋白激酶C作为一种范式。IUBMB Life 60，782–789。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型