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。2014年5月；57(5):1047-56.
doi:10.1007/s00125-014-3194-z。 Epub 2014年2月20日。

TIAM1-RAC1信号转轴介导NADPH氧化酶-2激活在糖尿病视网膜病变发展中引发线粒体损伤

雷努A科鲁鲁 1, 安贾内尤卢·科卢鲁, 拉贾克里什南·韦鲁塔卡尔, 古拉姆·穆罕默德, 伊斯梅尔·赛义德, 朱莉娅·桑托斯, 曼尼什·米什拉
附属公司

TIAM1-RAC1信号转轴介导NADPH氧化酶-2激活在糖尿病视网膜病变发展中引发线粒体损伤

雷努A科鲁鲁等。 糖尿病学。 2014年5月。

摘要

目的/假设：糖尿病患者在线粒体受损之前，视网膜氧化应激增加。吞噬细胞样NADPH氧化酶-2（NOX2）是活性氧（ROS）的主要细胞溶质来源。Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1（RAC1）是NOX2全酶成员，激活RAC1对NOX2激活和ROS生成是必要的。在本研究中，我们评估了T细胞淋巴瘤侵袭和转移（TIAM1）（RAC1的鸟嘌呤核苷酸交换因子）在糖毒性和糖尿病的体内外模型中RAC1和NOX2激活以及线粒体功能障碍发病中的作用。

方法：在暴露于高糖浓度下的牛视网膜内皮细胞、正常和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和小鼠视网膜以及患有糖尿病视网膜病变的人类供体视网膜中，对RAC1和NOX2激活、ROS生成、线粒体损伤和细胞凋亡进行量化。

结果：高糖激活RAC1和NOX2（表达和活性），增加内皮细胞中的ROS，然后增加线粒体ROS和线粒体DNA（mtDNA）损伤。N6-[2-[[4-（二乙氨基）-1-甲基丁基]氨基]-6-甲基-4-嘧啶基]-2-甲基-4,6-喹啉二胺三盐酸盐（NSC23766）是TIAM1-RAC1的已知抑制剂，显著减弱RAC1活化、总ROS和线粒体ROS、mtDNA损伤和细胞凋亡。糖尿病大鼠视网膜中NOX2表达增加，RAC1和p47（phox）的膜结合增加。糖尿病小鼠服用NSC23766可减弱视网膜RAC1激活和ROS生成。糖尿病视网膜病变患者的视网膜微血管中RAC1活化和p47（phox）表达也增加。

结论/解释：TIAM1-RAC1-NOX2信号轴在糖尿病的初始阶段被激活，以增加细胞内ROS，导致线粒体损伤和加速毛细血管细胞凋亡。针对TIAM1-RAC1信号的策略可能有助于在疾病早期阻止糖尿病视网膜病变的进展。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益的双重性作者声明，这份手稿不存在利益的双重性。

数字

图1
图1
NOX2激活示意图。NOX2全酶由胞质和膜质核心成分组成。激活后，细胞溶质核心移位并与膜核心结合以完成NOX2全酶组装，从而激活并生成ROS
图2
图2
细胞溶质ROS增加后，葡萄糖诱导牛视网膜内皮细胞线粒体损伤。如图所示，在没有或存在NSC23766的情况下，用葡萄糖培养细胞3-96小时。（a）总活性氧水平用荧光法定量。（b）使用MitoTracker Red荧光定量线粒体活性氧水平。（c）通过使用mtDNA长区域和短区域的引物，通过延长PCR评估mtDNA损伤（参见方法）。（d）mtDNA拷贝数通过定量COX2型水平并正常化为β-肌动蛋白。在三种或三种以上的细胞制备中，每次测量重复进行。数值表示为三到四个不同实验的平均值±SD；在5mmol/l葡萄糖中从细胞获得的值被认为是100%*第页与5 mmol/l葡萄糖相比，<0.05；†第页与20 mmol/l葡萄糖相比<0.05（无NSC23766）
图3
图3
暴露于高糖的牛视网膜内皮细胞中NOX2和RAC1激活的时间进程。细胞在5或20 mmol/l葡萄糖中培养3-96小时。（a）通过发光分析测定了载脂蛋白敏感的NOX2活性，并以任意单位（AU）表示。（b）gp91ds-tat肽或NSC23766抑制葡萄糖诱导的NOX2活性。（c） 二氧化氮用SYBR绿色定量PCR评估mRNA水平。（d）通过下拉试验测定RAC1活化（150μg蛋白质）。（e）如图所示，在没有或存在NSC23766的情况下，用低血糖和高糖培养的视网膜内皮细胞中RAC1激活的定量[8，11]*第页<0.05 vs 5 mmol/l葡萄糖；†第页<0.05 vs 20 mmol/l葡萄糖（无NSC23766）
图4
图4
NSC23766可防止葡萄糖诱导的视网膜内皮细胞加速凋亡。使用细胞死亡检测ELISA通过ELISA对细胞凋亡进行定量加号配套元件。在5mmol/l葡萄糖中孵育的细胞（对照），以及从这些细胞获得的值被设定为100%。结果表示为三个或三个以上实验的平均值±SD，每次测量两次*第页<0.05 vs 5 mmol/l和†第页<0.05 vs 20 mmol/l葡萄糖（无NSC23766）
图5
图5
增加否2RAC1和p47的表达、移位和膜结合凤凰（phox）糖尿病大鼠视网膜中。（a） 否2以β-actin为看家蛋白，qPCR定量视网膜mRNA水平。（b）对视网膜裂解物进行一步离心分离总颗粒和可溶性部分。RAC1和p47的相对丰度凤凰（phox）通过western印迹和密度测定进行定量，并表示为膜：胞浆比。结果表示为每组4或5只大鼠的平均±SD。正常、非糖尿病（正常）大鼠；糖尿病，糖尿病大鼠*第页与正常值相比<0.05
图6
图6
NSC23766给药可保护小鼠视网膜免受糖尿病诱导的ROS生成和RAC1激活的影响。对服用或不服用NSC23766（如方法所示）的糖尿病小鼠视网膜进行分析。RAC1激活（a），总ROS水平（b）BAX易位到线粒体部分（c）按照方法中的描述进行量化。数值以平均值±SD表示，每组5或6只小鼠进行两次测量，正常小鼠的数值（Norm）视为100%。糖尿病小鼠；NSC，NSC23766*第页与正常值相比<0.05；†第页<0.05 vs糖尿病
图7
图7
NOX2和p47的表达凤凰（phox）糖尿病视网膜病变患者的视网膜微血管中RAC1的激活增加。对记录有视网膜病变（Diab）的糖尿病患者和年龄匹配的非糖尿病患者（Norm）视网膜微血管的表达进行分析二氧化氮 （a）、RAC1激活（RAC1-GTP）和mRNA水平（b）和第47页凤凰（phox）表达（蛋白质和mRNA水平）（c）对非糖尿病和糖尿病供体的视网膜微血管进行两次测量(n个=4个）*第页<0.05 vs非糖尿病供体
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