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.2014年2月10日；25(2):139-51.
doi:10.1016/j.cr.2014.01.008。

PRKCI和SOX2癌基因共扩增并协同激活肺鳞癌中的Hedgehog信号

Verline Justilien公司 1, 迈克尔·P·沃尔什 1, 赛义德·A·阿里 1, E奥布里·汤普森 1, 妮可·默里 1, 艾伦·P·菲尔兹 2
附属公司

PRKCI和SOX2癌基因共扩增并协同激活肺鳞癌中的Hedgehog信号

Verline Justilien公司等。 癌细胞. .

摘要

我们报告了两个在染色体3q26上共同扩增的癌基因，PRKCI和SOX2，在肺鳞状细胞癌（LSCC）中协同驱动干样表型。蛋白激酶C（PKC）磷酸化SOX2，SOX2是茎干的主要转录调节因子，并将其招募到刺猬（Hh）酰基转移酶（HHAT）的启动子，该启动子催化Hh配体生成中的速率限制步骤。PKCⅠ介导的SOX2磷酸化是HHAT启动子占据、HHAT表达和维持干样表型所必需的。原发性LSCC肿瘤协调过度表达PKCⅠ、SOX2和HHAT，需要PKCⅠ-SOX2-HHAT信号来维持干样表型。因此，PKC l和SOX2在LSCC中具有遗传、生化和功能联系，它们通过建立细胞自主Hh信号轴共同驱动肿瘤发生。

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数字

图1
图1。肺癌癌球表现出干样特征
A）H1703、ChagoK1和H1299亲代贴壁细胞的相差显微照片(顶部面板)低粘附培养中的癌球(中间面板)以及回归贴壁培养后的再分化癌细胞(底部面板).B）假定干细胞标记的QPCR表示为亲本细胞+/-SEM的倍数，n=3*与NT粘附细胞相比，p<0.05。结果代表了五个独立实验。C）显微照片显示，在15天的时间内，单个细胞克隆性扩展到癌球。D）锚定非依赖性生长表现为亲代细胞+/-SEM的平均折叠变化。n=5，*与NT粘附细胞相比p<0.05。结果代表了五个独立实验。E）免疫低下小鼠肺原位肿瘤的形成。将10000个亲代H1299粘附细胞或癌细胞植入免疫缺陷小鼠的肺部。荷瘤小鼠生物发光图像的侧视图和背视图(一)以及相应的肺部解剖生物发光图像(b条). 典型父母肿瘤和癌球肿瘤的H&E(c（c）). 肿瘤球在注射部位发展为原发性肿瘤(箭头)同侧和对侧肺叶多发病变(箭头); 亲代细胞在注射部位形成单个小肿瘤(展示)或没有可识别的肿瘤。40倍放大显示癌球和亲代细胞源性肿瘤的相似形态(d日). 限制稀释H1299癌球和亲代细胞中肿瘤形成的发生率(e（电子）). IVIS对肿瘤生长的量化(（f）); 平均+/-SEM。与亲代细胞相比，*p<0.05 n=5，*p<0.05。另请参见图S1。
图2
图2。PKCⅠ是维持癌细胞干样表型所必需的
A）RNAi介导的PKCⅠ基因敲除的影响(免疫球蛋白t） H1703、H1299和ChagoK1癌球的非锚定生长。结果是相对于NT RNAi对照细胞+/-SEM表达的，n=5**p<0.001。B）球壳大小表示为平均直径，单位为μm+/-SEM。n=98（H1703）、138（H1299）和44（ChagoK1）。C）HHAT、GLI1、ADRBK1和CDK19的QPCR。结果表示为NT亲本细胞+/-SEM折叠，n=3*与NT父母相比，p<0.05。结果代表了三个独立的实验。D）SMO抑制剂LDE225对H1703、H1299和ChagoK1癌球的影响(继续。)和亲代细胞(标准。)扩散。结果以%DMSO对照+/−SEM表示；n=6。结果代表了三个独立的实验。另请参见图S2和表S1、S2和S3。
图3
图3。生物圈生长需要依赖PKC的Hh信号轴
一个和B）RNAi介导的HHAT和GLI1在H1299癌球中的敲除，分别表示为NT RNAi控制+/-SEM n=3的倍数*与NT对照组相比，p<0.0005。C）HHAT或GLI1 RNAi对克隆扩展的影响，以μm+/-SEM中的癌球直径表示，n>每个RNAi样本15个*p<1.0×10−06数据代表三个独立实验。D）相对于NT RNAi对照细胞+/−SEM表达的软琼脂生长，n=5；*p<0.003。数据是三个独立实验的代表。E）用指定量的Hh-Ag1.5（一种选择性Hh激动剂）处理NT、PKCⅠ、HHAT和GLI1癌球，并在5天后用MTT评估细胞增殖。结果表示为NT DMSO对照+/-SEM的%，n=6。F）癌球中棕榈酰化SHH的检测。父母(P（P）)和癌球(哦)表达FLAG-SHH的NT、PKC l和HHAT RNAi培养物用w-烷基棕榈酸酯进行代谢标记(第16号)和棕榈酰化SHH(手掌-SHH)和总SHH检测结果如所述实验程序.G）肿块生长为肺原位肿瘤。通过IVIS成像检测生物发光来监测NT亲本和NT、PKCⅠ、HHAT和GLI1 RNAi癌细胞肿瘤的生长。数据表示为每秒光子总通量±SEM；n=每组10人，PKC l除外，其中n=9人*p<0.05与NT RNAi癌球肿瘤显著不同。另请参见图S3。
图4
图4。PKC l通过控制HHAT启动子的SOX2占用来调节HHAT的表达
A）H1299癌球中SOX2的RNAi介导敲除。结果以%NT对照+/−SEM表示；n=3，*p<0.05。B）克隆膨胀用μm+/-SEM中的瘤球直径表示；n个>每个RNAi样本22个，p<3.0×10−14和是三个独立实验的代表。C）相对于NT RNAi对照细胞的锚定非依赖性生长+/−SEM，n=5*p<5.0×10−9结果代表了三个独立实验。D）染色质免疫沉淀（ChIP）分析以评估HHAT启动子的SOX2占用。示意图描述了HHAT启动子区域；显示了使用的ChIP探针的位置(一个和B类); 共识SOX2结合位点用垂直斜线表示。数据表示为输入的%；n=3+/−扫描电镜。*p<0.00002**p<0.00003。数据是两个独立实验的代表。E）和F）SOX2 RNAi对癌细胞HHAT表达的影响。数据是相对于NT RNAi控制细胞+/-SEM表达的*p<0.0007，是三个独立实验的代表。G）PRKCI公司和SOX2标准放大(上部面板)和过度表达(下部面板)在原发性LSCC肿瘤中。红条，肿瘤放大(上部面板)或过度表达(下部面板); 蓝色条，肿瘤表达减少；灰色条，基因拷贝数无变化的肿瘤(上部面板)或表达式(下部面板).H）原发性LSCC肿瘤中PRKCI、SOX2、HHAT和GLI1表达分析。原发性LSCC肿瘤根据PRKCI的表达进行强制排序，并分为对应于PRKCI高表达和低表达的顶部和底部三分位。方框图表示在表达低PRKCI的肿瘤中PRKCI、SOX2、HHAT和GLI1的表达(低的)和高PRKCI(高的). 条形代表中间值，方框表示25%和75%的间隔；胡须代表90%的置信区间。另请参见图S4和表S4和S5。
图5
图5。初级LSCC细胞需要PKCⅦ、SOX2和HHAT来形成和增殖癌球
A）三个手术切除的原发性LSCC肿瘤的癌球相位对比显微照片。B）PKCι、SOX2、HHAT和GLI1的QPCR分析以%NT RNAi对照+/−SEM表示，n=3，*p<0.02。C）MTT法检测癌球增殖，表达为%NT RNAi对照+/-SEM；n=3，*p<4.0×10−07.D）癌球的克隆扩张。结果表示为%NT RNAi对照+/-SEM；n=3，*p<0.0002。E）NT、PKCⅠ、SOX2和HHAT KD癌球的显微照片。箭头膜起泡表明细胞死亡。结果代表了三个独立的实验。
图6
图6。PKC l在一个独特的位点T118直接磷酸化SOX2，这是SOX2功能所必需的
A）重组人SOX2在含有32在不存在或存在重组PKCι的情况下的P-ATP。放射自显影法检测磷酸化SOX2，免疫印迹法检测总SOX2。B）SOX2蛋白结构示意图；HMG=高迁移率基团域，TAD=反式激活域，NLS=核定位序列。质谱分析显示，SOX2在T118有一个单一的PKCⅠ介导的磷酸化位点，符合普遍存在的非典型PKC磷酸化位点基序(插入).C类)对稳定转导NT或SOX2 RNAi的H1299癌细胞进行免疫印迹分析，然后稳定转染空载体（V）或编码WT-SOX2（WT）、T118A-SOX2（T118A）或T118D-SOX2突变体的载体。D）相对于NT RNAi对照细胞+/-SEM表达的HHAT和GLI1的QPCR分析；n=3，*p<0.03。E）克隆扩展相对于NT RNAi对照细胞+/−SEM表达；n> 每种电池类型20个，*p<1.0×10−08.F）软琼脂生长相对于NT RNAi对照细胞+/−SEM表达；n=5，*p<4.0×10−05G）T118-SOX2磷酸化突变体的细胞定位和启动子占用。FLAG、层蛋白A/C和MEK1细胞质和核组分的免疫印迹分析(免疫印迹). 层蛋白A/C是细胞核的标记，MEK1是细胞质的标记。HHAT促销员入住率(条形图，下部面板)表示为IgG对照+/-SEM的倍数；n＝3*p<0.001。中的结果D-G公司是三个独立实验的代表。另请参见图S5。
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