Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers

doi:10.1073/pnas.1316793111

.2014年2月25日；111(8):3128-33.

doi:10.1073/pnas.1316793111。 Epub 2014年2月11日。

功能表观遗传学方法将BRM/SMARCA2确定为BRG1缺陷癌症的关键合成致死靶点

附属机构

PMID： 24520176
预防性维修识别码：项目经理3939885
内政部： 10.1073/pnas.1316793111

功能表观遗传学方法将BRM/SMARCA2确定为BRG1缺陷癌症的关键合成致死靶点

格雷戈里·霍夫曼等。美国国家科学院程序. 2014.

.2014年2月25日；111(8):3128-33.

doi:10.1073/pnas.1316793111。 Epub 2014年2月11日。

附属

¹马萨诸塞州剑桥诺华生物医学研究院发育和分子途径及肿瘤学系，邮编02139。

PMID： 24520176
预防性维修识别码：项目经理3939885
内政部： 10.1073/pnas.1316793111

摘要

表观遗传调控缺陷在癌症的发展中起着基础性作用，表观遗传调节因子最近已成为有希望的治疗候选药物。因此，我们开始通过筛选58个癌细胞系的表观基因组为中心的深覆盖设计shRNA（DECODER）文库，系统地研究表观遗传癌症依赖性。该筛查确定BRM/SMARCA2是哺乳动物SWI/SNF（mSWI/SNF）染色质重塑复合体的一种依赖DNA的ATP酶，对于BRG1/SMARCA4中功能缺失突变的肿瘤细胞的生长至关重要。BRG1缺乏的癌细胞中BRM的耗尽导致细胞周期停滞、衰老诱导和全球H3K9me3水平升高。我们进一步证明了BRG1突变肿瘤对体内BRM的选择性依赖性。mSWI/SNF染色质重塑复合物的遗传改变是癌症染色质调节因子中最常见的，约10-15%的肺癌发生BRG1/SMARCA4突变。我们的发现将BRM定位为BRG1突变癌症的一个有吸引力的治疗靶点。由于BRG1和BRM作为mSWI/SNF复合物的互斥催化亚单位发挥作用，我们认为这种合成致死性可以用副作用不足来解释，其中一个家族成员的缺失揭示了对副作用亚单位的严重依赖性。这种“癌选择性副log依赖性”的概念可能为靶向具有副log亚单位的其他肿瘤抑制病变/复合物提供了一种更通用的策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
表观基因组范围的混合shRNA筛选将BRM识别为*BRG1公司*-突变癌细胞。(A类)shRNA筛选工作流程示意图。(B类)散点图显示了原始质粒池中表观基因组shRNA文库中每个shRNA的标准化计数，该散点图是相对于一个样本进行的五次群体倍增后绘制的*KRAS公司*-突变型胰腺癌细胞株Mia-Paca-2。以KRAS为靶点的17个shRNAs以紫色突出显示，说明大多数KRAS shRNA在实验期间的代表性缺失。画实线表示计数没有变化，而虚线表示计数变化±1.5倍。(C)表观基因组shRNA库中所有元素的排名显示，BRM在屏幕上的排名最高。根据平均对数的差异计算库中每个基因的等级*P（P）*通过使用敏感细胞系相对于不敏感细胞系的RSA统计计算的值。突出显示了KRAS的排名，以说明选择性抑制生长的阳性对照的表现*KRAS公司*-突变细胞系。

**图2。**
BRG1的完全缺失和BRM的保留定义了癌细胞对BRM-靶向shRNAs的生长抑制反应。(A类)显示原木的瀑布图*P（P）*如图1所示，使用BRM shRNAs的RSA统计计算的值C并根据BRG1突变状态（即纯合、杂合、BRG1/BRM双重缺失）着色。(B类)代表性蛋白质印迹*BRG1公司*-显示BRG1和BRM表达的WT和突变细胞系。VINCULIN包含在装载控制中。BRG1-WT细胞系保留BRG1表达，而*BRG1公司*对BRM shRNAs敏感的纯合突变细胞系（表示为+）缺乏BRG1表达，但保留BRM表达。

**图3。**
BRM耗竭显著且选择性地抑制了*BRG1公司*-突变癌细胞。(A类)Western blot显示经dox处理（120 h，100 ng/mL）后BRM蛋白减少*BRG1公司*-用诱导型BRM shRNA-2025或5537稳定转导突变/缺陷NCI-H838细胞。包括一个非靶向CTL shRNA。(B类)Western blot，如A类但在*BRG1公司*-WT NCI-H460细胞。(C)将CTL或BRM shRNA NCI-H838细胞以每孔500个细胞的速度接种在96-well板中，一式三份。用dox处理细胞，并在指定时间使用细胞滴度glo测定法测量细胞生长。所有分析均一式三份，数值显示为平均值±标准偏差(D类)细胞生长测定，如D类但与CTL或BRM shRNA NCI-H460细胞结合。(电子)CTL或BRM shRNA NCI-H838细胞以每孔2000个细胞接种。用dox（100 ng/mL）处理细胞，11天后用结晶紫染色监测菌落形成。(F类)将CTL或BRM shRNA NCI-H460细胞以每孔1000个接种量接种，用dox处理，并监测克隆形成情况，如电子.

**图4。**
双重而非单一BRG1和BRM敲除抑制*BRG1公司*WT电池。(A类)Western blot检测CTL shRNA、BRG1 shRNA-2202、BRM shRNA-2025或含有双（BRG1 sh RNA-202和BRM shRNA-2025）shRNA的BEAS2B细胞（非转化/永生化）裂解液中BRG1和BRM-水平，这些细胞经dox或不经dox处理3天。β-肌动蛋白用作负荷对照。(B类)将含有CTL、BRG1 shRNA2202、BRM shRNA-2025或双（BRG1 sh RNA-2202和BRM shRNA-2025）shRNA的BEAS2B细胞以每孔500个细胞接种，并用或不用dox处理10天。用结晶紫染色监测集落形成。(C)含有CTL shRNA、BRG1 shRNA-2202、BRM shRNA-2025或双（BRG1 shRNA-2202和BRM shRNA-2025）shRNA的裂解物中BRG1和BRM水平的蛋白质印迹*BRG1公司*WT NCI-H460肺癌细胞，使用或不使用dox治疗3天。β-管蛋白用作负荷对照。(D类)CTL、BRG1 shRNA-2202、BRM shRNA-2025或双（BRG1 shoRNA-2022和BRM shRNA-2025）shRNA包含*BRG1公司*将WT NCI-H460肺癌细胞接种在6孔板中，用或不用dox处理11或16天。通过台盼蓝排除试验量化细胞数量，并将每个细胞系归一化为–dox样本。所示实验是三个独立实验的代表。

**图5。**
BRM敲除不会干扰核心mSWI/SNF亚单位的相互作用，并导致细胞周期停滞和衰老，伴随着H3K9me3的诱导。(A类)Western blot显示在核心亚单位BAF155或SNF5免疫沉淀后检测mSWI/SNF亚单位，在缺乏或存在dox诱导的BRM敲除的情况下*BRG1公司*-突变细胞系NCI-H838。(B类)将含有NCI-H838细胞的BRM shRNA-2025用或不用dox处理7天，并通过碘化丙啶染色分析DNA含量来评估细胞周期的变化。显示G的单元格百分比₁、S和G₂相位内容显示在每个柱状图上。(C)用dox诱导含有CTL shRNA或BRM shRNA的NCI-H838细胞7 d，并监测衰老相关β-半乳糖苷酶染色（蓝色沉淀物）。(D类)用dox诱导含有CTL shRNA或BRM shRNA的NCI-H838细胞7 d，并对H3K9me3和DAPI进行染色。

**图6。**
BRM敲除抑制*BRG1公司*-体内突变肿瘤。NCI-H1299癌细胞稳定表达dox诱导的CTL shRNA或两种不同的*BRM公司*-将靶向shRNAs（sh2025或sh5537）接种到小鼠体内。用载体或dox对荷瘤小鼠进行治疗。(A类)治疗7天后肿瘤BRM和VINCULIN（负荷控制）的Western blot。(B类)治疗7天后BRM IHC染色的代表性图像。(C)治疗7天后BRM阳性细胞核的百分比。图表表示平均值±SEM(n个=每个治疗组3个）。(D类和电子)NCI-H1299标准(D类)或NCI-H460(电子)将稳定表达dox-inducible CTL、sh2025或sh5537 BRM shRNA的癌细胞接种到小鼠体内。当肿瘤体积达到100–300 mm时^三，小鼠连续服用载体饮食（黑圈）或补充dox的饮食（白圈）。将溶媒和脱氧治疗小鼠的肿瘤体积绘制为平均值±SEM(n个=每个治疗组8个）**P（P）*与车用治疗组相比，dox的Δ肿瘤体积<0.05。(F类)7天治疗后NCI-H1299肿瘤Ki67 IHC染色的代表性图像。(*G公司*)治疗7天后，NCI-H1299肿瘤中Ki67阳性细胞核的百分比。图表表示平均值±SEM(n个=每个治疗组3个）。

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