Structural bases for the interaction and stabilization of the human amino acid transporter LAT2 with its ancillary protein 4F2hc

doi:10.1073/pnas.1323779111

.2014年2月25日；111(8):2966-71.

doi:10.1073/pnas.1323779111。 Epub 2014年2月10日。

人类氨基酸转运蛋白LAT2与其辅助蛋白4F2hc相互作用和稳定的结构基础

阿尔伯特·罗塞尔¹, 马塞尔·默里, 埃琳娜·阿尔瓦雷斯-马里蒙, Meritxell Costa公司, 劳拉·佩雷斯-卡诺, 安东尼奥·佐扎诺, 胡安·费尔南德斯·雷西奥, 曼努埃尔·帕拉辛, Dimitrios Fotiadis公司

附属公司

PMID： 24516142
PMCID公司：下午3939895
内政部： 10.1073/pnas.1323779111

人类氨基酸转运蛋白LAT2与其辅助蛋白4F2hc相互作用和稳定的结构基础

阿尔伯特·罗塞尔等。美国国家科学院程序. 2014.

.2014年2月25日；111(8):2966-71.

doi:10.1073/pnas.1323779111。 Epub 2014年2月10日。

作者

附属

¹巴塞罗那生物医学研究所（IRB Barcelona），西班牙巴塞罗那E-08028。

PMID： 24516142
PMCID公司：项目经理3939895
内政部： 10.1073/pnas.1323779111

摘要

异聚氨基酸转运蛋白（HAT）是由两个由保守的二硫键连接的亚基组成的溶质转运蛋白的独特例子，在所有生命王国中都是已知的。在后生动物中，重亚基负责将异二聚体运输到质膜，而轻亚基则是转运蛋白。HAT与人体病理有关，如氨基酸尿症、肿瘤生长和侵袭、病毒感染和可卡因成瘾。然而，关于HAT重亚基和轻亚基之间相互作用的结构信息很少。在这项工作中，通过透射电镜和单粒子分析纯化的人4F2hc/L型氨基酸转运蛋白2（LAT2）异二聚体在毕赤酵母中过度表达，结合对接分析和交联实验，揭示了4F2hc的胞外结构域与LAT2相互作用，几乎完全覆盖了转运蛋白的细胞外表面。4F2hc增加了洗涤剂溶解的毕赤酵母膜中轻亚单位LAT2的稳定性，允许异二聚体功能性重组为蛋白质脂质体。此外，4F2hc的胞外结构域足以稳定溶解的LAT2。4F2hc与LAT2的相互作用揭示了轻亚基识别的结构基础以及HAT中辅助蛋白的稳定作用。

关键词：4F2hc外结构域；CD98hc。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
人类4F2hc/LAT2的TEM、SPA和3D重建。(A类)纯化的负染4F2hc/LAT2异二聚体的电子显微照片概述。盒装的4F2hc/LAT2复合物被放大并陈列在画廊中。箭头标记来自受损异二聚体的4F2hc或LAT2单体。星号表示蛋白质聚集体较小。（比例尺：50 nm。）画廊中放大粒子的帧大小为21.8 nm。(B类)根据阴性染色异二聚体颗粒的投影计算4F2hc/LAT2的三维重建。显示了三维模型的不同侧视图。4F2hc/LAT2由大密度和小密度组成。小密度位于大密度的顶部，并且是倾斜的，如黑色虚线所示。如箭头所示，三维模型具有一个独特的空腔。相反，两个亚单位紧密接触，如白色虚线所示。（比例尺：5 nm。）(C类)侧面(上部)和顶部(下部)4F2hc/LAT2三维重建视图，无4F2hc-ED的拟合晶体结构，也有4F2hc/ED的拟合水晶结构（蛋白质数据库ID代码：2DH2）。拟合将大小亚单位分别分配给4F2hc和LAT2。4F2hc-ED的结构表示为卡通和曲面模型。星号表示4F2hc-ED晶体结构中N端的位置。（比例尺：5 nm。）

**图2。**
4F2hc/LAT2的交联以及4F2hc-ED和LAT2复合体的对接模型。(A类和C类)亚单位间交联。用DTT不可清除交联剂BMOE或BM（POE）处理HEK293T细胞中表达并通过His亲和色谱纯化的不同版本的His-4F2hc/Strep-LAT2异二聚体₂在还原条件下使用αStrep抗体进行Western blotting，检测到交联为DTT-resistant 4F2hc/LAT2异二聚体（箭头）。LAT2单体的带对应于LAT2与4F2hc形成异二聚体（即铜化但未交联）。在4F2hc（C330S）/LAT2野生型中引入了单半胱氨酸突变体(A类)或LAT2（C210S）(C类). 在所有情况下，当使用4F2hc（C330S）或LAT2（C210S）时，交联被取消，表明交联位点的特异性。(B类)4F2hc-ED–LAT2复合物的最低能量模型。高亮显示的半胱氨酸残基（内源性或通过突变添加）显示为球形模型（C原子，灰色；O原子，红色；N原子，蓝色；S原子，黄色）。假定的N个-4F2hc的糖基化位点（N264、N280、N323和N405用紫色表示）和非交联残基（C185和C393用灰色表示）位于最外面。(D类)交联残留物概述。中的4F2hc-ED–LAT2模型B类旋转90°，即从4F2hc-ED来看。只有4F2hc/ED的半胱氨酸残基（内源性或通过突变添加的）显示为带有绿色C原子的球形模型。在LAT2（蓝色卡通）中，半胱氨酸残基（内源性或通过突变添加的）显示为带有灰色C原子的球体模型。交联残基通过一条表示交联百分比的线连接（实线红线：80–95%；实线黄线：～60%；红色虚线：5–10%）。类似地，C109（4F2hc）和C154（LAT2）之间的亚单位间二硫键桥由一条实心红线表示，因为它存在于>95%的表达的LAT2中（有关详细信息，请参阅正文）。

**图3。**
(A类)纯化的4F2hc/LAT2（粗曲线）和纯化的LAT2（细曲线）的尺寸排阻色谱图谱。4F2hc/LAT2在9.8 mL洗脱，而LAT2在空隙体积（8 mL）中洗脱。(B类)时间进程我-在4F2hc/LAT2和4F2hc蛋白脂质体中摄取亮氨酸。运输10µM我-[^三H] 在10、30、60、90、120、150、180和210分钟以及在20小时时测量亮氨酸进入蛋白脂质体。用4mM冷的蛋白脂质体加载或不加载蛋白脂质体我-异亮氨酸。数据为代表性实验的平均值±SEM，一式三份。10µM的传输我-[^三H] 4 mM预载4F2hc/LAT2蛋白脂质体中的亮氨酸我-异亮氨酸导致超调。相反，我-亮氨酸在不含氨基酸的4F2hc/LAT2蛋白脂质体中的转运表现出被动扩散，类似于4F2hc蛋白脂质体填充或不填充我-异亮氨酸。这种行为是耦合输送器（如H）的特征⁺/乳糖协同转运蛋白LacY（27）和交换器，如LAT转运蛋白SteT我-丝氨酸/我-苏氨酸交换器*枯草芽孢杆菌*(28).

**图4。**
4F2hc-ED增加LAT2的溶解度和稳定性。(A类)如图所示，在1 mg/mL 4F2hc-ED或BSA或普通缓冲液中对DDM-可溶性LAT2进行Western blot分析。(B类)在不同时间，在存在或不存在1mg/mL 4F2hc-ED的情况下，对可溶性LAT2（1%DDM）进行Western blot分析。(C类)在指定时间定量可溶性LAT2。数据是三个独立实验的平均值±SEM，如B类.超速离心后残留在溶液中的LAT2被视为可溶性LAT2。使用αStrep抗体检测LAT2。4F2hc-ED的存在在所有分析时间都增加了LAT2的稳定性。

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