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.2014年4月；62(4):608-22.
doi:10.1002/glia.22629。 Epub 2014年1月30日。

Na~+/K~+-ATPase、NKCC1和Kir4.1对海马K~+清除和容积反应的贡献

布莱恩·罗兰·拉森 1, Mette Assentoft公司, 玛丽亚·L·科特里娜, 苏珊·Z·华, 梅肯·内德加德, 凯凯拉, Juha Voipio公司, 南娜·麦考利
附属公司

Na~+/K~+-ATPase、NKCC1和Kir4.1对海马K~+清除和容积反应的贡献

布莱恩·罗兰·拉森等。 格利亚. 2014年4月.

摘要

大脑中的网络活动与细胞外钾（+）浓度的短暂增加有关。通过涉及Kir4.1介导的空间缓冲、Na（+）/K（+）/2Cl（-）协同转运蛋白1（NKCC1）和/或Na（+/K（+-ATP酶活性的机制，多余的K（+。他们对[K（+）]o管理的个人贡献一直备受争议。本研究旨在通过几种互补的方法描述Kir4.1、NKCC1和Na（+）/K（+）-ATPase的转运特性，并解决它们参与清除细胞外K（＋）瞬变的问题。大鼠星形胶质细胞的原代培养显示出强大的NKCC1活性，[K（+）]o增加到基础水平以上。增加[K（+）]o可产生NKCC1介导的培养星形胶质细胞肿胀，因此NKCC1可能作为K（+。在大鼠海马脑片中，NKCC1的抑制未能影响细胞外间隙K（+）的去除率，而Kir4.1仅在局部[K（+。相反，抑制Na（+）/K（+）-ATPase的不同亚型可降低刺激后K（+”瞬变清除率。当在爪蟾卵母细胞中表达时，星形胶质细胞特征性的Na（+）/K（+）-ATP酶的α2β2亚基组成显示出K（+）亲和力和电压敏感性，这将使该亚基组成专门用于控制神经元活动期间的[K（+）]o。在大鼠海马脑片中，同时测量细胞外间隙体积表明，Kir4.1、NKCC1和Na（+）/K（+）-ATPase均不能解释刺激引起的细胞外间隙收缩。因此，NKCC1在天然海马组织中活性诱导的细胞外钾（+）恢复中不起作用，而Kir4.1和Na（+）/K（+）-ATP酶在时间上起着不同的作用。

关键词：哺乳动物脑细胞体积变化；细胞外离子稳态；离子传输。

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数字

图1
图1
K（K）+-NKCC1和Na的刺激活性+/K（K）+-ATP酶.（A-C） 86卢比+大鼠星形胶质细胞原代培养中的摄取：NKCC1依赖性摄取作为布美他尼敏感（10μM）部分获得(A类)在确保时间线性（插入）和Na之后+/K（K）+-作为哇巴因敏感（1 mM）部分的ATP酶依赖性摄取(B)根据Michaelis-Menten动力学拟合各个实验，并绘制为V的平均%最大值作为[K的函数+]o个（n=4个实验，用K进行三次0.5在平均之前从每个单独的实验中获得）。(C)NKCC1和Na的分数贡献+/K（K）+-ATP酶对每个K的总摄取量+浓度。(D类)rNKCC1表达的布美他尼敏感（10μM）摄取非洲爪蟾根据Michaelis-Menten动力学拟合卵母细胞，并绘制V的平均百分比最大值作为[K的函数+]o个而K0.5在平均值之前从每个单独的实验中获得（n=3个实验，每个条件10个卵母细胞）。
图2
图2
K（K）+-诱导NKCC1介导的星形细胞肿胀.在含有0 mM K的对照溶液的微流控细胞体积传感器中，获得了培养星形胶质细胞细胞体积的稳定基线记录+. (A类)将细胞突然暴露于含有15 mM K的等渗试液中+如左面板中的黑色条所示。返回0 mM K后+暴露在15 mM K下15分钟+诱导的星形细胞肿胀率（中间面板）与最初追踪中获得的速率相似。K系列+-右图中加入布美他尼（10μM）可消除诱导的星形细胞肿胀。(B)与（A）中一样，但使用3 mM K+在对照溶液中，然后用含有7 mM K的试验溶液进行等渗激发+（左侧面板）。K系列+-右图中加入布美他尼（10μM）可消除诱导的星形细胞肿胀。(C)微流控池体积传感器的示意图，该传感器具有两个外部电极（电流在其之间传递）和两个内部电极（电压在其之间测量）。
图3
图3
NKCC1对K无贡献+-海马脑片的清除和细胞外空间收缩。采用离子敏感微电极同时测量细胞外[K+]o个和细胞外间隙的相对大小（添加1.5 mM TMA后+至试验溶液）。(A类)对CA1（插入）中的放射状地层进行电刺激（20 Hz，10秒），产生场电位。[K中刺激诱发变化的代表性痕迹+]o个之前（黑色痕迹）和之后（灰色痕迹）暴露于布美他尼（10μM）。虚线表示直线段（r2在所有实验中≥0.99），用于量化K+衰减率。(B)在与（A）相同的局部区域同时获得的相对细胞外间隙的代表性记录；黑色痕迹表示对照痕迹，灰色痕迹表示在布美他尼存在下获得的痕迹。(C)刺激后数据的归一化和汇总[K+]o个衰变率（左图）和细胞外空间收缩率（右图）：布美他奈对[K没有影响+]o个衰变率（对照组96.7±8.8%，n=4）或相对细胞外间隙（对照组94.3±4.8%，n=4）。数据以平均值±SEM表示，并通过Student配对t检验确定统计显著性。
图4
图4
Kir4.1对刺激后K没有贡献+-海马脑片的清除和细胞外间隙收缩.用离子敏感微电极测定钡的作用2+-Kir4.1对K的介导抑制+间隙和细胞外空间收缩，基本如图3所示。(A类)[K中刺激诱发变化的代表性痕迹+]o个BaCl暴露前（黑色痕迹）和暴露后（灰色痕迹）2（100μM），左侧面板。虚线标记线性段（带有r2在所有实验中≥0.99），用于量化K+衰减率。在BaCl存在下获得的数据2对[K的衰减率进行了归一化控制和总结+]o个刺激后（对照组的88.7±10.6%，n=5）和钾离子导入+（111.0±7.4%的控制，n=4），右侧面板。(B)在与（A）相同的局部区域同时获得的相对细胞外空间的代表性记录；黑色痕迹表示控制痕迹，灰色痕迹表示在BaCl存在下获得的痕迹2，左侧面板。BaCl存在下刺激引起的细胞外间隙收缩率2将其归一化为对照组，并在右侧面板中总结（98.0±9.0%的对照组，n=3）（其中两项与K同时进行+测量，其中一项是单独监测细胞外间隙）。(C)K的焦点应用+在含有抑制剂混合物（AP-5 40μM，NBQX 10μM，PiTX 100μM，CGP-55845 1μM，TTX 1μM）的情况下，通过5秒电流脉冲（由黑条指示）的离子导入获得。连续的离子导入脉冲导致[K的相同增加+]o个（插入）。[K变化的代表性痕迹+]o个BaCl暴露前（黑色痕迹）和暴露后（灰色痕迹）2（100μM），左侧面板。虚线标记线性段（带有r2在所有实验中≥0.99），用于量化K+衰变率，在这组实验中，由于快速衰变，从而失去线性，涵盖1秒的范围，见（a），右侧面板中的汇总数据。峰值[K+]o个在BaCl存在下获得的值2将其归一化为对照组，并在右侧面板中进行总结（122.1±5.1%，n=4）。数据表示为平均值±SEM，统计显著性由单因素方差分析和Dunnett的多重比较确定事后（post-hoc）test和Student的配对t检验（**；对< 0.01).
图5
图5
钠的抑制+/K（K）+-ATP酶延迟K+-海马脑片清除率。用离子敏感微电极测定哇巴因对钾的影响+电刺激后的间隙，基本上如图3所示。(A类)[K中刺激诱发变化的代表性痕迹+]o个在对照溶液（黑色痕迹）中，暴露于5μM哇巴因（深灰色痕迹），然后暴露于50μM哇巴因（浅灰色痕迹）。虚线标记线性2秒截面（带r2在所有实验中≥0.99），用于量化K+衰减率。(B）独立实验中相对细胞外空间的代表性记录；黑色痕迹表示控制痕迹，灰色痕迹表示使用5μM哇巴因后的记录。插入物描述了用50μM哇巴因（浅灰色痕迹）获得的类似实验。(C)[K+]o个将在哇巴因存在下获得的衰变率归一化为对照组，并对其进行总结（5μM哇巴因为对照组的69.3±9.3%，n=7，50μM哇巴因为对照的31.5±7.8%，n=5），左侧面板。将哇巴因存在时刺激引起的细胞外间隙收缩率归一化为对照组，并在右侧面板进行总结（对照组的99.3±4.4%，5μM哇巴因的n=3，对照组的131±15%，50μM哇巴因的n=4）。数据表示为平均值±SEM，统计显著性由单因素方差分析和Dunnett的多重比较确定事后（post-hoc）测试（*；对< 0.05, ***,对< 0.001).
图6
图6
Na的亚单位星座+/K（K）+-ATP酶决定其K+-和电压敏感性.钠的各种亚基亚型组成+/K（K）+-ATP酶（α1β1、α1β2、α2β1、β2、β1、非洲爪蟾卵母细胞及其活性用双电极电压钳测定。(A类)从−50 mV的保持电位开始，将膜电位阶跃至0 mV，然后以20 mV的增量将其阶跃至−100 mV，持续200 msec（插入中描述了阶跃协议）。该面板显示了α2β2表达的卵母细胞在暴露于1 mM哇巴因之前（上迹线）和之后（下迹线）的代表性电流迹线。(B)Na人+/K（K）+-ATP酶活性测定为[K+]o个（V时米=−80 mV），并根据Michaelis-Menten动力学进行拟合。该图描述了在每个[K+]o个作为V的%最大值±SEM，而亲和常数是在平均之前从每个卵母细胞获得的，n=4-7）。(C)K系列0.5将每个亚单位亚型组成的s绘制为膜电位的函数（V米)，n=4-7。(D类)在5 mM K的存在下，获得了每个亚基组成的哇巴因敏感性I/V关系+（n=6-8个）。将数据归一化为在−60 mV的膜电位下获得的电流。数据表示为平均值±SEM，并通过单向方差分析和Tukey多重比较确定统计显著性临时的测试或学生t-test。
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